[发明专利]含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及阳离子脂质以及转基因载体，具体涉及一种同时含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN₃类阳离子脂质、含该类阳离子脂质的转基因载体及其制备方法。

背景技术

基因治疗是将外源正常的基因通过一定的方法导入靶细胞，代替或者补偿一些缺陷或者异常的基因以达到治疗的目的。基因治疗为很多疾病的治疗提供了可能性，如：癌症、糖尿病、囊胞性纤维症、艾滋病、心血管疾病等。

基因治疗的关键是是要把治疗基因高效地导入细胞内，然而裸露的DNA 一般以舒展的线型螺旋形式存在，体积较大，并且DNA分子本身为带负电的阴离子，进入细胞时会与细胞膜外层的阴离子之间产生静电排斥作用。这些不利因素都使得DNA分子在不借助其它技术手段的情况下，无法独立穿过细胞膜，因此发展有效的基因载体是基因治疗成功的前提条件。

基因载体包括病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体是一种高效的转染试剂，但是它存在缺点，如免疫原性、致癌性，基因的大小容易受到病毒所容纳的大小限制、同时存在变异的可能性，因此其安全性令人担忧。非病毒载体无免疫原性、便于大规模生产。但是，由于目前的大部分基因载体缺乏荧光标记基团，所以，非病毒载体在细胞内分布以及运输途径还不清楚，而且非病毒载体的跨膜水平、内化途径以及内涵体地逃离机制也不是很清楚，同时，由于目前的大多数载体缺乏靶向基团，对细胞的选择性比较差且转染效率低。因此开发低毒高效具有荧光基团和靶向基团的非病毒基因载体具有重要意义。

发明内容

作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，在大环多胺[12]aneN₃类阳离子脂质中同时引入靶向基团胆酸和荧光基团萘酰亚胺，之后形成的转基因载体不仅能够在同一个细胞内监测载体/DNA复合物在细胞内的转运以及释放，而且对肝癌细胞具有一定的选择性。基于这种发现，完成了本发明。

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种具有多功能的大环多胺[12]aneN₃阳离子脂质的转基因载体，不仅能够在同一个细胞内监测载体/DNA复合物在细胞内的转运以及释放，而且对肝癌细胞具有一定的选择性，以促进基因治疗的发展。

本发明还有一个目的是提供含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN₃类阳离子脂质的制备方法以及含有该阳离子脂质的转基因载体的制备方法。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质，所述阳离子脂质的结构式如下：

本发明的目的还可以进一步由含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质的制备方法来实现，该方法的合成路线如下：

所述方法具体步骤包括：

步骤一、按比例称取式3化合物、式2化合物、催化剂、缩合剂和有机碱，加入溶剂溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析分离得到式4化合物；

步骤二、所述步骤一得到的式4化合物与癸二胺在乙二醇单甲醚溶剂中回流，反应结束后，冷却、过滤、洗涤与柱层析分离得到式5化合物；

步骤三、将所述步骤二得到的式5化合物、催化剂、缩合剂、式6化合物与有机碱加入无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析分离得到式7化合物；

步骤四、将所述步骤三得到的式7化合物、式8化合物溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液，将溶有硫酸铜和维生素C的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中，室温下反应8～10小时，反应结束后，加入水，二氯甲烷萃取，柱层析分离得到式9化合物；

步骤五、将所述步骤四得到的式9化合物加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应，析出固体，然后将固体过滤，得到式1化合物阳离子脂质。

优选的是，其中，在所述步骤一中，所述式2化合物和所述式3化合物的物质的量的比为1:1，所述催化剂为1-羟基苯并三唑，所述缩合剂为1-乙基 -(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺，柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为 20:1。