[发明专利]一种从脐带华通氏胶组织中分离培养脐带间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及脐带间充质干细胞的稳定分离提取方法，特别是从脐带华通氏胶组织中分离培养间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，存在于全身结缔组织和器官间质中。MSC于20世纪70年代末首次发现于骨髓中，然而直到上个世纪90年代，MSC多向分化潜能被人们认识后，这种干细胞才受到越来越多的关注。

间充质干细胞属于多能干细胞，目前已有研究表明，MSC可以经诱导分化为脂肪、骨、骨韧带、神经、肝、心肌、内皮、胰岛等多种组织细胞以及类细胞；并且发现，间充质干细胞在免疫抑制、内分泌系统调节、神经系统调节以及心血管功能改善等方面均具有明显的功效。

目前对间充质干细胞的提取研究也已较为广泛，包括从脂肪、骨髓、羊水、胎盘、脐带组织、脐带血、牙周等人体多种组织和器官中进行提取。其中脐带来源的间充质干细胞由于生长环境单一、体外提取方便，使得提取的间充质干细胞纯度高、数量大，可以成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，具有更广阔的临床应用潜能。

鉴于脐带多能干细胞的多向分化潜能以及在疾病治疗领域的应用潜力，目前国内市场的脐带间充质干细胞的存储业务具有广阔的前景，因此，如何高效规范的保证干细胞的分离提取率，以及保证干细胞优质，从而满足未来干细胞移植的临床需求，是目前国内干细胞存储业务亟待解决的问题。

目前脐带间充质干细胞多采用酶消化法和组织贴壁法来制备，然而在分离提取过程中，红细胞的干扰是影响脐带间充质干细胞质量和数量的重要因素，大量红细胞的存在使得间充质干细胞的生长空间受限，同时影响干细胞的活力状态，对脐带间充质干细胞分离提取与开发利用造成了很大的影响。

发明内容

本发明的目的是针对本领域的需要，提供一种能够克服红细胞干扰的改进的脐带间充质干细胞分离提取方法。

本发明的另一目的是提供通过本发明的方法获得的脐带间充质干细胞。

具体而言，本发明针对目前国内外人脐带间充质干细胞的提取现状，利用红细胞裂解液并采取悬浮培养从新鲜脐带华通氏胶组织中分离原代间充质干细胞，利用无血清培养体系原代培养并进行稳定传代，以提高脐带间充质干细胞的分离提取成功率和细胞纯度，为人脐带间充质干细胞的临床应用提供可能。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供了从新鲜脐带离体组织华通氏胶中分离和提取间充质干细胞的方法，其为一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，所述方法包括：采用红细胞裂解液处理从脐带分离的华通氏胶组织，并采用间充质干细胞无血清培养基进行培养。

本发明采用的红细胞裂解液为包含NH₄Cl和Na₂-EDTA的水溶液，优选为包含1-20g/L的NH₄Cl和0.05-0.2mMNa₂-EDTA的水溶液，更优选为包含5-10g/L的NH₄Cl和0.1mMNa₂-EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4。在使用之前，过0.22μm微滤膜，平衡至室温。

本发明采用的间充质干细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物。

优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。

根据本申请的具体实施方式，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司货号为11140的产品。