[发明专利]一种从脐带华通氏胶组织中分离培养脐带间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：采用红细胞裂解液处理从脐带分离的华通氏胶组织，并采用间充质干细胞无血清培养基进行培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红细胞裂解液为包含NH₄Cl和Na₂-EDTA的水溶液，优选为包含1-20g/L的NH₄Cl和0.05-0.2mMNa₂-EDTA的水溶液，更优选为包含5-10g/L的NH₄Cl和0.1mMNa₂-EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物；

优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；

更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；

最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将获得的华通氏胶组织分割成组织块，加入1-3倍组织块体积的所述红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后采用间充质干细胞无血清培养基培养获得的华通氏胶组织块，以获得原代间充质干细胞；

优选地，所述方法包括：将经清洗的脐带华通氏胶组织剪成1-3mm³大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后将获得的组织块均匀铺在培养皿中达60-80％的覆盖，加入3-5倍组织块体积的间充质干细胞无血清培养基，在37℃和5％浓度的CO₂下培养，3-5天时半量更换新鲜培养基，5-15天时待组织块下均匀爬出细胞后，去掉组织块，全量更换新鲜间充质干细胞无血清培养基继续培养，此后每3-4天进行一次新鲜培养基更换。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)脐带组织的预处理：

将新鲜脐带分割成小段，去除血管淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离华通氏胶组织，加入PBS缓冲液清洗；

(2)红细胞裂解液处理：

将经步骤(1)获得的华通氏胶组织分割成组织块，加入红细胞裂解液处理，离心收集经处理的组织块，加入PBS缓冲液清洗；

(3)原代培养：

采用间充质干细胞无血清培养基培养经步骤(2)获得的华通氏胶组织块，以获得原代间充质干细胞；

优选地，所述方法还包括以下步骤：

(4)上清液检测：

取步骤(3)中培养细胞的上清液，检测以下项目中的一种或多种：甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素；

(5)传代培养：

取步骤(4)中检测项目为阴性的培养细胞，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养，收集细胞备用、冻存或继续传代；

(6)细胞检测：

取步骤(5)中培养的细胞，检测以下项目中的一种或多种：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。