[发明专利]一种快速鉴定双歧杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及双歧杆菌，尤其是一种快速鉴定双歧杆菌的分子生物学方法。

背景技术

双歧杆菌是一类厌氧的革兰氏阳性细菌，按照伯杰细菌鉴定手册的分类，双歧杆菌属于放线菌目放线菌科双歧杆菌属。双歧杆菌为外观变化很大的杆状体，菌株的一般特征是呈分叉的Y型或V型，以及棍棒状或者匙状类型。1899年，法国巴斯德研究院人员首先从母乳喂养的婴儿粪便中分离出了第一株双歧杆菌，之后越来越多的科学家及研究者们开始了对双歧杆菌的研究工作。并且实践表明，双歧杆菌是存在于人和其它动物肠道内的一类有益菌，人体肠道内双歧杆菌的数量，在婴幼儿时期含量最为丰富，随着年龄的增长，比例逐渐缩小。定殖于人体肠道内的双歧杆菌，在抑制有害菌群、维持肠道菌群平衡、促进肠道蠕动、改善便秘、缓解由抗生素引起的腹泻、提高宿主免疫力等方面发挥着重要的作用。

随着对双歧杆菌研究的深入，以及对双歧杆菌类产品的开发，如何快速获得具有潜在益生特性的双歧杆菌菌株成为亟待解决的问题。而对于双歧杆菌的鉴定，是其中不可或缺的重要部分。目前，对于双歧杆菌的菌种鉴定，常用的方法主要有两种：一是基于形态学和生理生化特性(主要是糖代谢不同)进行的传统鉴定方法；二是基于分子生物学手段，对菌株的基因进行测定，其中最常用的是PCR扩增双歧杆菌的16SrDNA片段，将双歧杆菌鉴定到种的水平。然而，这两种方法在一定程度上都存在某种不可避免的缺陷性。传统的形态学及生理生化鉴定方法，由于双歧杆菌的形态多变性以及代谢底物的细微差别，很难将双歧杆菌鉴定到种的水平。并且存在工作量大，费事费力的缺点。而采用16SrDNA片段进行测序的方法，虽然可以准确鉴定到种，但存在程序繁琐的缺点。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)的工作原理是，根据DNA的解链特性，不同碱基组成的双螺旋DNA发生变性所需变性剂的浓度不同。混合的双链DNA在进行变性剂浓度呈线性变化的电泳时，相同碱基组成的DNA在同一变性剂浓度的位置发生解链，不同碱基组成的DNA在不同变性剂浓度的位置发生解链，由于迁移速率的不同而停留在凝胶中的不同位置，从而将混合的DNA片段分离开来。此技术可以将仅有一对碱基差别的DNA片段分离开来。而双歧杆菌的16SrDNA的V3区为高度可变区，理论上可以通过DGGE手段将不同种的双歧杆菌鉴定出来。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种鉴定双歧杆菌的方法(CN102108400A)，涉及一种鉴定双歧杆菌的方法，具体涉及一种新的鉴定双歧杆菌的分子生物学方法。该方法通过对双歧杆菌16SrDNA上两段目标基因片段及丙酮酸激酶编码基因上一段目标基因片段的PCR扩增和测序分析，可以将双歧杆菌菌株鉴定到种的水平。本发明将为双歧杆菌鉴定提供一种更加准确、更易于操作的实用方法，有利于双歧杆菌菌株的分类及研究工作。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种快速、准确地鉴定双歧杆菌的方法，该方法可以将双歧杆菌鉴定到种或亚种的水平，为双歧杆菌的分离鉴定及进一步研究提供一种可靠手段。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种快速鉴定双歧杆菌的方法，采用PCR-DGGE的方法，将未知菌株与标准菌株的条带进行比对，将未知双歧杆菌鉴定到种或亚种的水平。

而且，步骤如下：

⑴提取已知基因序列的不同种双歧杆菌的基因组；

⑵采用合适引物对，进行PCR扩增单菌的16SrDNA的V3区；

⑶采用变性梯度凝胶电泳方法构建标准指纹图谱；

⑷将未知的双歧杆菌条带与标准条带进行比对，确定未知双歧杆菌的种类。

而且，所述步骤⑴中已知基因序列的双歧杆菌为短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种和长双歧杆菌婴儿亚种。

而且，所述步骤⑴中提取双歧杆菌基因组的方法是酚-氯仿抽提法。

而且，所述步骤⑵中引物对为338f-GC和518r。

而且，所述引物338f-GC的碱基序列为5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；引物518r的碱基序列为5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。