[发明专利]一种快速鉴定双歧杆菌的方法

权利要求书

1.一种快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：采用PCR-DGGE的方法，将未知菌株与标准菌株的条带进行比对，将未知双歧杆菌鉴定到种或亚种的水平。

2.根据权利要求1所述的快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴提取已知基因序列的不同种双歧杆菌的基因组；

⑵采用合适引物对，进行PCR扩增单菌的16SrDNA的V3区；

⑶采用变性梯度凝胶电泳方法构建标准指纹图谱；

⑷将未知的双歧杆菌条带与标准条带进行比对，确定未知双歧杆菌的种类。

3.根据权利要求2所述的快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：所述步骤⑴中已知基因序列的双歧杆菌为短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种和长双歧杆菌婴儿亚种。

4.根据权利要求2所述的快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：所述步骤⑴中提取双歧杆菌基因组的方法是酚-氯仿抽提法。

5.根据权利要求2所述的快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：所述步骤⑵中引物对为338f-GC和518r。

6.根据权利要求5所述的快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：所述引物338f-GC的碱基序列为SEQ1；引物518r的碱基序列为SEQ2。

7.根据权利要求2所述的快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：所述步骤⑵中PCR的扩增条件为：95℃，5min；94℃，45s，65℃，45s，每个循环降0.5℃，72℃，30s，20个循环；94℃，50s，55℃55s，72℃30s，15个循环；72℃10min。

8.根据权利要求2所述的快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：所述步骤⑶中变性梯度凝胶电泳方法所用的胶为30％～70％的聚丙烯酰胺。

9.根据权利要求2所述的快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：所述步骤⑶中变性梯度凝胶电泳方法的电泳条件是：120V，30min；80V，12h；缓冲液为1×TAE；温度为60℃。

10.根据权利要求1至3任一项所述的快速鉴定双歧杆菌的方法，其特征在于：具体步骤如下：

(一)培养基与培养条件

培养基：MRS+5‰半胱氨酸，121℃灭菌15min；培养条件：37℃，取已知基因序列的不同种双歧杆菌于厌氧工作站培养24h，得菌悬液；

(二)基因组提取

⑴取培养过夜的菌悬液1mL于1.5mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；

⑵用1mL无菌水吹打洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；

⑶向菌体中加入200uLSDS裂解液，80℃水浴30min，得菌体裂解液；

⑷加入酚-氯仿溶液200uL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为：Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200uL；

⑸加入400uL冰乙醇或冰异丙醇于200uL上清中，-20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；

⑹加入500uL体积百分数为70％的冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；

⑺60℃烘箱烘干，或者自然晾干，得沉淀；

⑻50uLddH₂O重溶沉淀，以备PCR；

(三)16SrDNAV3区引物

上游引物338f-GC，碱基序列：SEQ1；

下游引物518r，碱基序列：SEQ2；

(四)PCR反应体系50μL：

10×Taqbuffer，5μL；dNTP，5μL；338f-GC20μM，0.5μL；518r20μM，0.5μL；Taq酶，0.5μL；DNA模板，0.5μL；ddH₂O，38μL；

(五)PCR反应程序

95℃，5min；94℃，45s，65℃，45s每个循环降0.5℃，72℃，30s，20个循环；94℃，50s，55℃55s，72℃30s15个循环；72℃，保持10min；

(六)琼脂糖电泳

⑴配制质量百分数1％的琼脂糖凝胶：每大胶40mL，称取0.4g琼脂糖置于锥形瓶中，加入40mL的0.5×TBE，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，待溶液冷至不烫手，加入4μL10000×的核酸染料，混匀后倒入模具中，凝固30min以上；

⑵将基因组DNA样品/PCR产物样品与10×Loadingbuffer混合后，加入样品槽中；

⑶接通电源，120V，跑30min；

⑷电泳结束后，用凝胶成像仪拍照；

(七)变性梯度凝胶电泳的操作

⑴溶液配制

①50×TAE电泳缓冲液：tris242g，Na₂EDTA·2H₂O37.2g，加800mL去离子水，充分混匀，加57.1mL冰醋酸，充分混匀，加去离子水至1L，混合；

②0％变性剂100mL：质量百分数40％的丙烯酰胺，20mL；50×TAE电泳缓冲液，2mL；dH₂O，78mL，过0.45μm滤膜，超声脱气10-15min，置于棕色试剂瓶中；

③100％变性剂100mL：质量百分数40％的丙烯酰胺，20mL；50×TAE电泳缓冲液，2mL；甲酰胺，40mL；尿素，42g；dH₂O，至100mL，过0.45μm滤膜，超声脱气10-15min，置于棕色试剂瓶中，使用前须在温水浴中重溶；

④10％过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶解于1mLdH₂O中，-20℃储存；

⑵制胶

①将两片大小不一致的玻璃板清洗干净，干燥；

②将两个间隔条置于大块玻璃板两侧边缘，外边缘与玻璃板边缘相齐，间隔条的槽朝上，将小块玻璃板置于间隔条上，并与之对齐，并将该夹层结构用夹子固定好，竖起后中间插入校准板校正，两边固定螺丝旋紧；

③将海绵垫固定在制胶架上，将夹层结构连同夹子一起固定在制胶架上，加入去离子水，验漏，确定不漏后将水倒掉并用滤纸将残留的水吸干；

④分别配制30％和70％的凝胶，其中，30％的胶：0％变性剂，14mL；100％变性剂，6mL；四甲基乙二胺，10μL；10％过硫酸铵，80μL；

70％的胶：0％变性剂，6mL；100％变性剂，14mL；四甲基乙二胺，10μL；10％过硫酸铵，80μL；

⑤两个注射器分别吸入30％和70％的凝胶后，排出气泡，按照顶部进胶的低浓度和高浓度固定在梯度传送系统上，连接上Y形管，小心赶走气泡；

⑥针头对准玻璃板中心位置，针孔朝向大块玻璃板，轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，保持匀速，使溶液恒速被灌入三明治式的凝胶板中；

⑦小心插入梳子，让凝胶聚合一个小时，迅速清洗用完的设备，尤其是洗掉Y形管中残留的液体，以免堵塞；

⑧电泳槽内加入7L1×TAE缓冲溶液，其由50×TAE缓冲溶液稀释而得，打开电泳控制装置，预热电泳缓冲液到60℃；

⑨聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到60℃；

⑶上样：PCR产物中加了加样缓冲液后，每个胶孔加20μL；

⑷电泳：120V，30min后80V，12h，遵循的原则为电压V×时间h为1000；

⑸染色

①电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后连同另一块玻璃板将胶放入托盘中，胶朝上；

②GelRed稀释液：30mL水+3μL10000×GelRed混匀，即得，避光保存；

③用1mL的移液器将GelRed稀释液分3次加到胶上，每次10mL，须覆盖点样孔对应区域，每次加完后等10min，托盘须盖上盖子避光；

④加去离子水没过胶，避光30min；

⑤轻轻晃动托盘，使水进入胶和玻璃板之间，慢慢使其分离，取出玻璃板；

⑹显影：凝胶成像仪下紫外显影，拍照；

(八)未知双歧杆菌的DGGE鉴定

按照实施例(二)至(六)的操作步骤，获得未知双歧杆菌的16SrDNAV3区的PCR产物；

以双歧杆菌的混合标准指纹图谱作为Marker，对未知的双歧杆菌进行鉴定。