[发明专利]用于检测艰难梭菌的四环素耐药基因（tet M）的LAMP试剂盒及其专用引物

权利要求书

1.用于检测艰难梭菌的四环素耐药基因tet M的LAMP引物，是根据艰难梭菌的四环素耐药基因tet M如序列表中SEQ ID NO：1所示的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测肌肉、血液、粪便等样品中的艰难梭菌的四环素耐药基因tet M，所述LAMP引物由五条引物组成，包括核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的外引物tet M-F3和tetM-B3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的内引物tet M-FIP和tet M-BIP、以及SEQ ID NO：5所示的环引物tet M-LB的组合。

2.根据权利要求1所述的用于检测艰难梭菌的四环素耐药基因tet M的LAMP引物，其特征在于：所述的LAMP引物，为外引物tet M-F3和tet M-B3、内引物tet M-FIP和tet M-BIP及环引物tet M-LB按摩尔比1：8：3的组合物。

3.一种用于对艰难梭菌的四环素耐药基因tet M进行LAMP检测的试剂盒，包括权利要求1或2所述用于对艰难梭菌的四环素耐药基因tet M进行LAMP检测的引物。

4.根据权利要求3所述的用于对艰难梭菌的四环素耐药基因tet M进行LAMP检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于25μL反应体系的试剂：Mixture 20.9μL，引物加入量分别为：①50mM引物tet M-F3 0.1μL，使终浓度为5pmol；②50mM引物tet M-B3 0.1μL，使终浓度为5pmol；③50mM引物tet M-FIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；④50mM引物tet M-BIP 0.8μL，使终浓度为40pmol⑤50mM引物tet M-LB 0.3μL，使终浓度为15pmol；所述Mixture主要成分包括：2mM pH 8.8的Tris·HCl 0.7μL，10mM KCl 3.8μL，10mM(NH₄)₂SO₄3.8μL，0.1％Tween20 0.4μL，0.8M甜菜碱0.3μL，8mM MgSO₄ 3μL，1.4mM dNTP each 0.5μL，8U Bst DNA polymerase 1μL，ddH₂O 7.4μL。

5.根据权利要求3或4所述的用于对艰难梭菌的四环素耐药基因tet M进行LAMP检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含四环素耐药基因tet M的艰难梭菌基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的双蒸水或去离子水。

6.权利要求1或2所述的LAMP引物在制备艰难梭菌的四环素耐药基因tet M的LAMP检测试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于：艰难梭菌的四环素耐药基因tet M的LAMP检测，包括以下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增，LAMP反应体系为：待测样品的基因组DNA 2μL，Mixture 20.9μL，引物加入量分别为：①50mM引物tet M-F30.1μL，使终浓度为5pmol；②50mM引物tet M-B3 0.1μL，使终浓度为5pmol；③50mM引物tetM-FIP 0.8μL，使终浓度为40pmol；④50mM引物tet M-BIP 0.8μL，使终浓度为40pmol⑤50mM引物tet M-LB 0.3μL，使终浓度为15pmol；LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温60min；

2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在艰难梭菌的四环素耐药基因tet M，结果阳性，橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌的四环素耐药基因tet M，结果阴性；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，比浊度≥0.1时浊度上升表示待测样品中存在艰难梭菌的四环素耐药基因tet M，结果阳性，浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌的四环素耐药基因tet M，结果阴性。