[发明专利]混合型己酸菌培养液的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用浓香型白酒窖泥己酸菌来制作混合型己酸菌培养液的生产方法。

背景技术

己酸菌（Clostridiumkluyveri）又称梭状芽孢杆菌，属于兼性厌氧微生物，其形状典型的为梭状，另外还有短杆型、长杆型等。己酸菌是浓香型白酒生产中非常重要的产酸微生物，茅台试点发现己酸菌后，浓香型白酒的生产有了飞跃式的发展。浓香型白酒生产品质也有了较大的提高，这充分说明了己酸菌在浓香型白酒生产中占有非常重要的作用。古贝春白酒拥有百年的生产历史，老窖池中存在优良的己酸菌，为己酸菌的分离和应用提供了优越的条件。

己酸菌的筛选工作如下：

取优质窖泥1g,摇床粉碎，梯度稀释，80℃热水浴处理10分钟，加入到巴氏培养基中混匀，倒平板，厌氧条件培养。巴氏培养基（固体）配方：乙酸钠0.5％．硫酸铵0.05％，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.04％，酵母膏0.1％，琼脂粉2%，乙醇2％(121度灭菌后，倒平板前加入)，碳酸钙1％(稍后加)，水100％。厌氧环境培养，培养7～10天，菌落长出来了，用无菌刀切取菌落，反复纯化，也可镜检观察，己酸菌为梭状芽孢杆菌。经过几次纯化后便得到纯种菌株。

己酸菌株情况验证，采用液体巴氏培养基（配方同上）将分离提纯的菌株分别培养7～10天，以备验证。

己酸菌的定性分析：取4ml混合均匀的巴氏培养基菌液，加入2%的乙酸铜溶液1ml，然后加入乙醚1ml，震荡，静置，观察乙醚层的颜色，黄绿色越深说明产己酸越多，表明筛选计算菌株越优良。反复几次验证，观察己酸菌株是否有衰退情况。

经过多次筛选得到优良己酸菌株命名为CK-j1，经与标准菌种比对，属于己酸菌。

现有己酸菌培养液的生产，成本高，人工多，操作复杂，不适合生产厂家应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种混合型己酸菌培养液的生产方法，解决生产成本高、操作繁琐复杂等问题。

本发明的目的是还提供了混合型己酸菌培养液应用方法和再生产方法。

本发明所采用的技术方案是混合型己酸菌培养液的生产方法，包括如下步骤：

（1）培养基配方如下：1000mL水，乙酸钠8～10g,硫酸镁0.3～0.4g，硫酸铵0.8～1g，酵母膏1.5～2.5g，磷酸氢二钾0.6～0.8g，1.5～2.5g碳酸钙（单独灭菌），20～25mL乙醇（不灭菌单独加入）；

（2）121℃度下，培养基灭菌20分钟；

（3）将己酸菌（CK-j1）接种于培养基中，接种容器为若干250mL三角瓶，碳酸钙、乙醇加入培养基，每个250mL三角瓶需加入15～20mL的己酸菌菌种，接种后需将没有接种的培养基加入到已经接种的三角瓶中，以液面在三角瓶口颈部离三角瓶顶端瓶口4～5cm为宜，接种后采用液体石蜡液封培养，石蜡的使用量为1～1.5mL，接种三瓶，每瓶300～330mL，在33～35℃条件下活化培养5～7天，制得己酸菌种子液，己酸菌浓度为1.5～5.0×10⁸CFU/mL，可以作为一级种子液使用；

（4）按体积5%～8%的比例提取一级种子液，接种于二级己酸菌菌种培养基中，接种容器为若干5L三角瓶，二级己酸菌菌种培养基配方同上述培养基的配方,碳酸钙、乙醇加入培养基，每个5L三角瓶需加入300～400mL的一级种子液，接种后需将没有接种的培养基加入到已经接种的三角瓶中，以液面在三角瓶口颈部离三角瓶顶端瓶口4～7cm为宜，接种后采用液体石蜡液封培养，石蜡的使用量为2～3mL，将接种后的二级己酸菌菌种培养基在33～35℃的条件下培养10～12天，己酸菌浓度为1.5～2.5×10⁸CFU/mL，可以作为二级种子液使用，可进行大规模生产接种；