[发明专利]一种提高家蚕蛹体重量的方法

权利要求书

1.一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

1)解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；

2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA；

3)再以BmCrzRcDNA为模板，通过PCR扩增得到BmCrzRDNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接，获得pFLAG-BmCrzR；

4)以pFLAG-BmCrzR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-BmCrzRDNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为893bp的目的DNA片段，作为反应模板；

5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后再进行多次处理得到BmCrzRdsRNA；

6)给五龄第2-3天家蚕幼虫腹部注射10-20μgBmCrzRdsRNA，用桑叶饲养至成熟结茧，获得重量增加的家蚕蛹体。

2.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

所述步骤1)具体为：解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：65℃变性5min，42℃反应60min，70℃灭活15min，获得第1链cDNA。

3.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

所述步骤2)具体为：以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTGCCACCATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCCGTAACAAACTAATGTTCTGTCCATTCG-3’进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA。

4.根据权利要求3所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

所述的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环。

5.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：

所述步骤3)得到BmCrzRDNA片段具体采用以下方式为：以BmCrzRcDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’和反向引物5’-GGATCCTTATAACAAACTAATGTTCTGTCCAT-3’进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，加rTaq酶继续延伸15min，得到DNA片段。

6.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：所述步骤4)得到pFLAG-BmCrzRDNA片段具体采用以下方式为：以pFLAG-BmCrzR为模板，分别用两个特异性引物5′-AAGCTTATGAACTCAGAAACAATAAACGACAC-3′和5′-GGATCCTTAACAGTTCGTGTTGAAGTATGTTTC-3′进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，得到DNA片段。

7.根据权利要求1所述的一种提高家蚕蛹体重量的方法，其特征在于：所述步骤5)具体为：

5.1)在一试管内依次加入1-2μg反应模板、2μL10×T7反应缓冲液、2μLATP液、2μLCTP液、2μLGTP液、2μLUTP溶液和2μLT7酶混合物；

5.2)补充无核酸酶的双蒸馏水至20μL，充分混合，放置于37℃反应16h，冷却至常温；

5.3)在上述混合液中加入1μLTURBODNA酶，混匀后，37℃下孵育15min；

5.4)再加入30μL无核酸酶的双蒸馏水、30μL7.5M氯化锂和50mMEDTA，终止反应；

5.5)于4℃下15000rpm离心15min，除去上清液，加入1mL70％乙醇洗涤；

5.6)于4℃下15000rpm离心15min，除去70％乙醇上清液，将沉淀用无核酸酶的双蒸馏水溶解，得到BmCrzRdsRNA。