[发明专利]一种鸡GM-CSF蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种鸡GM-CSF蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

细胞因子是一类由活性细胞分泌的可溶性的多肽或蛋白，通过与细胞表面的受体相互作用发挥特殊的生物活性。细胞因子具有明显的免疫佐剂效应，可增强病毒疫苗、细菌疫苗和寄生虫疫苗的保护效应。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由T细胞、B细胞、巨噬细胞、内皮细胞等在某些抗原和细胞因子作用下刺激产生的具有多种生物学活性的一类细胞因子。GM-CSF不仅能刺激造血细胞增殖、分化和成熟，并从骨髓向外周转移,而且还能活化中性粒细胞、巨噬细胞、及其他单核细胞,在细胞因子网络中占有重要地位,在免疫反应中具有重要作用。GM-CSF通过促进包括树突状细胞在内的抗原递呈细胞的增殖分化,将其吸引到注射部位,增强抗原递呈能力,从而达到增强免疫效果的作用。因此GM-CSF作为免疫佐剂具有很广阔的发展前景。

Dranoff等首次将GM-CSF作为免疫佐剂，增强了抗肿瘤疫苗的免疫反应，因而被大量用作DNA疫苗的免疫佐剂，以克服DNA疫苗免疫原性差的缺陷。2004年，Avery等从鸡cDNA文库中筛选到与人GM-CSF同源的鸡GM-CSFcDNA。2008年谭兵克隆了四川山地乌骨鸡的GM-CSF基因，并用大肠杆菌表达载体表达了该蛋白。2011年刘贺山也利用大肠杆菌表达载体表达了GM-CSF基因。而利用昆虫表达系统制备鸡GM-CSF蛋白的相关基础研究,国内外未见报道。昆虫细胞表达系统具有突出的优点，例如：表达水平高、易于放大、生产的蛋白带有适当的翻译后修饰，而且细胞生长条件简单。因此较细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统等更具潜在的发展优势。

鸡传染性法氏囊病(infectiousbursaldisease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)侵害引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害雏鸡和青年鸡的法氏囊。该病不仅造成鸡只死亡还导致免疫抑制，是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。随着变异株和超强毒株的出现，传统疫苗的研制速度已经难于跟上该病的变化。单一抗原VP2的基因工程疫苗预防鸡传染性法氏囊病虽然效果不错，但是也存在免疫反应不够强，免疫原性弱、保护力相对不够高等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白表达水平高、易于放大、利于大规模生产需要的鸡GM-CSF蛋白的制备方法，本发明还提供该方法制得的鸡GM-CSF蛋白以及该蛋白的应用。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种鸡GM-CSF蛋白的制备方法，包括如下步骤：

a.合成优化的编码鸡GM-CSF蛋白的核苷酸序列，所述优化的编码鸡GM-CSF蛋白的核苷酸序列如序列SEQIDNo:1所示；

b.利用SEQIDNo:1所示序列构建表达载体，所述表达载体为：pFastBac1-his-thrombin-GM-CSF；

c.将经过b步骤得到的表达载体进行病毒包装，得到病毒原种；

d.将经过c步骤得到的病毒原种进行扩增培养(通过扩增培养，可以提高病毒滴度)，然后收集扩增后的培养基上清液并用收集到的上清液感染对数期的sf9细胞，然后在培养基中培养感染后的sf9细胞24-72h，收集培养基中的上清，经离心、层析处理，，得到鸡GM-CSF蛋白。

本发明中，优选的方案为所述a步骤中合成SEQIDNo:1所示序列具体为：以昆虫细胞偏爱密码子对编码鸡GM-CSF蛋白的基因序列进行密码子优化，即得；所述编码鸡GM-CSF蛋白为GeneBank公布的编号为NO：EU939770的序列。

本发明中，优选的方案为所述a步骤中SEQIDNo:1所示序列通过化学法合成。

本发明中，优选的方案为所述b步骤中利用SEQIDNo:1所示序列构建表达载体包括如下步骤：

1)将SEQIDNo:1序列克隆到pUC57载体质粒上，得到pUC57-GM-CSF载体质粒；

2)将pUC57-GM-CSF载体质粒进行PCR扩增，其中PCR扩增中所采用的引物对为：

上游引物1：5‘-ATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCCTCGCTCAGCTCACTATCCTCCT-3’；

上游引物2：5‘-CGCGGATCCATGCATCACCATCACCATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCCTCG-3’；