[发明专利]一种鸡GM-CSF蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种鸡GM-CSF蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

a.合成优化的编码鸡GM-CSF蛋白的核苷酸序列，所述优化的编码鸡GM-CSF蛋白的核苷酸序列如序列SEQIDNo:1所示；

b.利用SEQIDNo:1所示序列构建表达载体，所述表达载体为：pFastBac1-his-thrombin-GM-CSF；

c.将经过b步骤得到的表达载体进行病毒包装，得到病毒原种；

d.将经过c步骤得到的病毒原种进行扩增培养，然后收集扩增后的培养基上清液并用收集到的上清液感染对数期的sf9细胞，然后在培养基中培养感染后的sf9细胞24-72h，收集培养基中的上清，经离心、层析处理，得到鸡GM-CSF蛋白。

2.根据权利要求1所述的鸡GM-CSF蛋白的制备方法，其特征在于所述a步骤中合成SEQIDNo:1所示序列具体为：以昆虫细胞偏爱密码子对编码鸡GM-CSF蛋白的基因序列进行密码子优化，即得；所述编码鸡GM-CSF蛋白为GeneBank公布的编号为NO：EU939770的序列。

3.根据权利要求1所述的鸡GM-CSF蛋白的制备方法，其特征在于：所述a步骤中SEQIDNo:1所示序列通过化学法合成。

4.根据权利要求1所述的鸡GM-CSF蛋白的制备方法，其特征在于所述b步骤中利用SEQIDNo:1所示序列构建表达载体包括如下步骤：

1)将SEQIDNo:1序列克隆到pUC57载体质粒上，得到pUC57-GM-CSF载体质粒；

2)将pUC57-GM-CSF载体质粒进行PCR扩增，其中PCR扩增中所采用的引物对为：

上游引物1：5‘-ATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCCTCGCTCAGCTCACTATCCTCCT-3’；

上游引物2：5‘-CGCGGATCCATGCATCACCATCACCATCACCTGGTGCCGCGCGGCAGCCTCG-3’；

下游引物：5‘-CCCAAGCTTTTAGATGCAATCTTTTTCTTCGGGC-3’；

先用上游引物1和下游引物对模板pUC57-GM-CSF载体质粒进行第一次PCR扩增，再用上游引物2和下游引物对第一次PCR扩增的产物进行第二次PCR扩增，所述第一次扩增与第二次扩增采用相同的PCR反应体系和扩增反应程序：

PCR扩增中每50μLPCR反应体系包括：5×Fastpfubuffer10μL，dNTPMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)2μL，反向引物(10μM)2μL，Fastpfupolymerase1μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，ddH₂O30μL；

PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃20s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min；

3)将步骤2)中扩增后的产物用电泳回收大小为471bp的条带，得到目的基因；其中，电泳回收所用到的胶床为琼脂糖凝胶；

4)将pFastBac1质粒及步骤3)中收集到的目的基因进行双酶切：

酶切反应在37℃水浴反应2h；

pFastBac1质粒酶切体系如下：质粒pFastBac11μg，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl，ddH2Oupto20μl；

目的基因酶切体系如下：PCR回收产物14μl，10×Buffer2μl，10×BSA2μl，BamHI1μl，HindIII1μl；

然后，分别回收质粒pFastBac1酶切大片段和目的基因酶切产物；

5)将步骤4回收到的质粒pFastBac1酶切大片段和目的基因酶切产物连接，连接反应在22℃反应2小时，得到连接产物；连接反应体系如下：目的基因酶切产物6μl，pFastBac1酶切大片段2μl，10×DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl；

6)将步骤5)得到的连接产物与100μlJM109感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激45s，立即置冰上放置2min,加入预热至室温的400μlLB培养基，37℃恒温摇床培养1h，4000rpm离心1min，弃去400μl培养上清，剩余100μl用移液器混匀后均匀涂布于含100μg/mlAmpicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜；

7)在步骤6)的在37℃恒温培养箱倒置培养过夜后的培养基中挑取1个单菌落接种于含5ml，100μg/mlAmpicillin抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，利用质粒BamHI+HindIII进行双酶切鉴定，然后将鉴定正确的重组克隆进行测序验证；接着，挑选正确的pFastBac1-his-thrombin-GM-CSF载体质粒进行克隆，备用。