[发明专利]SNP位点基因型分型的方法

说明书

本发明公开了一种SNP位点基因型分型的方法。该方法包括以下步骤：S1，对目标区域的DNA序列进行克隆测序和多重比对，确定待测SNP位点；S2，针对SNP位点设计PCR扩增引物，PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端对应待测SNP位点，将对应待测SNP位点的3'末端上的核苷酸进行LNA修饰；S3，采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增，并根据扩增产物中目的条带的有无确定待测样本的SNP位点基因型。应用本发明的技术方案，采用锁核酸引物进行PCR扩增以确定SNP位点的基因型，不仅增加了检测结果的精确性和可靠性，而且极大地提高了实验的灵活性，简化了配套条件并显著地降低了实验成本。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种SNP位点基因型分型的方法。

背景技术

锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)是指核苷酸糖环上的2'-O与4'-C由亚甲基桥相连的一类RNA衍生物，可以与DNA或RNA按照一般的碱基配对原则进行配对。这种桥连结构增加了核酸骨架的稳定性，提高了退火温度，增强了碱基配对的特异性，极大的降低了错配发生的概率。因此锁核酸在基因芯片、RNA干扰等许多领域得到了广泛的应用(Braasch,D.A.and D.R.Corey,Locked nucleic acid(LNA):fine-tuning the recognition ofDNAand RNA.Chemistry&biology,2001.8(1):p.1-7.)。

理论上，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的顺利进行是以模板单链与引物链按照碱基配对原则正确配对为前提。所以，在包含碱基差异的区域，设计一组只有单碱基差异的PCR引物，利用常见的PCR扩增仪，进行扩增，检测是否有符合设计片段长度的扩增产物产生，可以判断目标区域靶位点的碱基类型。但在使用常规PCR引物时，即使存在单碱基的错配，PCR反应有时也可以正常进行，得到与目的片段长度相同的扩增产物。因而使用常规引物进行PCR扩增分型时，无法排除假阳性结果，进而可能会得到错误的基因型分型结果。

目前，常用的SNP位点基因型检测方法主要有测序法、芯片法以及质谱法等，其中测序法价格比较昂贵，而芯片法和质谱法只有在同时测定多个位点或研究大群体样品时较有优势，且这三种方法都必须以相关的大型仪器平台作为支撑，存在多种局限。

发明内容

本发明旨在提供一种SNP位点基因型分型的方法，以解决现有技术中SNP位点基因型分型技术假阳性高或复杂、价格昂贵的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种SNP位点基因型分型的方法。该方法包括以下步骤：S1，对目标区域的DNA序列进行克隆测序和多重比对，确定待测SNP位点；S2，针对SNP位点设计PCR扩增引物，PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端对应待测SNP位点，对对应待测SNP位点的3'末端上的核苷酸进行LNA修饰；S3，采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增，并根据扩增产物中目的条带的有无确定待测样本的SNP位点基因型。

优选地，步骤S3中采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增是在通过梯度实验得到的最佳PCR扩增条件和反应体系下进行的。

优选地，对PCR扩增引物中的与模板杂交亲和程度高的引物3'末端进行LNA修饰。

优选地，PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端倒数第一个或倒数第二个核苷酸对应待测SNP位点。

优选地，待测样本为毛白杨，待测SNP位点位于纤维素合酶基因5上，PCR扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的3'末端上的倒数第一个核苷酸进行LNA修饰。