[发明专利]检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR引物及方法在审
| 申请号： | 201510863688.0 | 申请日： | 2015-12-01 |
| 公开（公告）号： | CN105296671A | 公开（公告）日： | 2016-02-03 |
| 发明（设计）人： | 方钟燎;李国坚;杨庆利;李海;陈钦艳;王学燕;谭超;胡莉萍;李开文 | 申请（专利权）人： | 广西壮族自治区疾病预防控制中心 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙) 11371 | 代理人： | 李进 |
| 地址： | 530000 广西壮*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 检测 乙肝病毒 bcp 敏感性 pcr 引物 方法 | ||
1.一种检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR引物，其特征在于，由第一对引物和第二对引物组成；第一对引物：CPF1a和CPR1mer；第二对引物：CPF2与CPR2或CPF2与CPR1mer；
其中，CPF1a基因序列如SEQIDNo.1所示，CPR1mer基因序列如SEQIDNo.2所示，CPF2基因序列如SEQIDNo.3所示，CPR2基因序列如SEQIDNo.4所示。
2.一种检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，其特征在于，以权利要求1中的第一对引物对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物；
以权利要求1中的第二对引物对所述第一轮PCR产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；
对所述第二轮PCR产物进行检测即可。
3.根据权利要求2所述的检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，其特征在于，所述待检测DNA是从待检血清或血浆中提取DNA而得；
优选地，CPR1mer基因序列中的K为G或者T，所述G与T按个数比为1:0.8-1.2添加到CPR1mer基因序列中。
4.根据权利要求2所述的检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，其特征在于，所述待检测DNA的数量级为4拷贝以上。
5.根据权利要求4所述的检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，其特征在于，所述第一轮PCR和所述第二轮PCR的反应体系的体积为10-50μl，优选为20-25μl。
6.根据权利要求5所述的检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，其特征在于，所述第一轮PCR的反应体系的体积为25μl，所述第一轮PCR的反应体系中含有ExTaq0.625±0.01U、dNTPs各0.4±0.02mM、含20mMMg2+的10×ExTaqBuffer2.5±0.1μl、20μmol/L的引物各0.5±0.1μl和待检测DNA，双蒸水补齐至25μl。
7.根据权利要求6所述的检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，其特征在于，所述第一轮PCR的程序为：94-95℃3-5min；94-95℃30±2s，68℃90±5s，40-45个循环；72℃4-5min。
8.根据权利要求7所述的检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，其特征在于，所述第二轮PCR的反应体系的体积为25μl，所述第二轮PCR的反应体系中含有ExTaq0.625±0.01U、dNTPs各0.4±0.02mM、含20mMMg2+的10×ExTaqBuffer2.5±0.1μl、20μmol/L的引物各0.5±0.1μl和第一轮PCR产物0.5-1.5μl，双蒸水补齐至25μl。
9.根据权利要求8所述的检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，其特征在于，所述第二轮PCR的程序为：94-95℃3-5min；94-95℃30±2s，68℃30±2s，40-45个循环；72℃3-5min。
10.根据权利要求2-9任一项所述的检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，其特征在于，对所述第二轮PCR产物采用毛细管电泳或琼脂糖凝胶水平电泳进行检测。
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