[发明专利]检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及一种检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR引物及方法。

背景技术

目前，乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)基因组变异的检测方法是建立在对HBV基因组全长序列或特定目标序列PCR扩增的基础上。通过PCR扩增可以识别出该病毒相应基因或区域的缺失等变异。发明人曾用巢式PCR方法对HBV核心基因包含其基本核心基因启动子(Basalcorepromoter,BCP)的区域(nt1678～1948)进行了扩增。由于引物设计以及HBV基因组负链自然缺失区域的影响，病毒载量较低(<10³～10⁵genomes/mL)的样本无法检出。

由于HBV基因组的部分双链结构，在其负链5’端存在2nt核苷酸自然缺口。而BCP则非常靠近HBV基因组负链5’端，PCR扩增要跨过那段不连续的基因片段，导致传统的扩增方法检出率较低，仅为60％左右。目前，通过改用病毒的直接重复序列上的引物P2，使检测的敏感性明显提高，可达90％左右。然而，该套引物的另一条位于X基因上，该基因包埋在基因组内层、且变异较多，导致PCR扩增结果仍存在局限性和不确定性。据统计，按照目前检测方法，仍有约10％HBsAg基因阳性标本检测不到其核心基因启动子目标序列。

HBV的BCP控制前核心基因RNA和前基因组RNA的转录，它的某些基因位点突变将能影响这些转录，有些突变与乙肝病毒的致癌有关，有些突变可用于预测肝癌发生的危险性。因此，如何扩增BCP成为研究的热点，其结果对于评估肝癌发生的危险性具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，采用全新的设计理念，设计特定的引物，使检出率提高到98％以上，灵敏度明显增高。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR的引物，由第一对引物和第二对引物组成；第一对引物：CPF1a和CPR1mer；第二对引物：CPF2与CPR2或CPF2与CPR1mer；

其中，CPF1a基因序列如SEQIDNo.1所示，CPR1mer基因序列如SEQIDNo.2所示，CPF2基因序列如SEQIDNo.3所示，CPR2基因序列如SEQIDNo.4所示。

本发明提供的用于检测乙肝病毒BCP的巢式PCR的引物，第一对引物中的上游引物选择HBV基因组中保守区域的S基因区段，引物位置选择811-834nt位；下游引物主要部分选择HBV(-)链5’端序列(17-20nt)，并覆盖GC缺口和3’端4个核苷酸，同时考虑HBV基因组1811位T/G多态性，设计包含此多态位点的兼并引物作为第一轮PCR反应的下游引物。第二对引物中的上游引物选择1677–1699nt位保守区域；下游引物选择1793-1812nt位保守区域或使用第一轮PCR的下游引物。这两对引物具有高特异、高灵敏度和高效的检测HBV基本核心基因启动子相关序列，其最低检测HBVDNA模板量可达4拷贝。

一种检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，以引物CPF1a和CPR1mer对待检测DNA进行第一轮PCR，得到第一轮PCR产物；

以引物CPF2与CPR2或CPF2与CPR1mer对所述第一轮PCR产物进行第二轮PCR，得到第二轮PCR产物；

对所述第二轮PCR产物进行检测即可；

其中，CPF1a基因序列如SEQIDNo.1所示，CPR1mer基因序列如SEQIDNo.2所示，CPF2基因序列如SEQIDNo.3所示，CPR2基因序列如SEQIDNo.4所示。

本发明提供的一种检测乙肝病毒BCP的高敏感性巢式PCR方法，第一轮PCR的上游引物选择HBV基因组中保守区域的S基因区段，引物位置选择811-834nt位；下游引物主要部分选择HBV(-)链5’端序列(17-20nt)，并覆盖GC缺口和3’端4个核苷酸，同时考虑HBV基因组1811位T/G多态性，设计包含此多态位点的兼并引物作为第一轮PCR反应的下游引物。第二轮PCR的上游引物选择1677–1699nt位保守区域；下游引物选择1793-1812nt位保守区域或使用第一轮PCR的下游引物。本发明是在长期实践的基础上，在HBV基本核心基因启动子相关序列的检测方法的基础上进行重新设计引物，逐渐探索出本发明的高特异、高灵敏度和高效的检测方法，其最低检测HBVDNA模板量可达4拷贝。