[发明专利]促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用。

背景技术

干细胞(StemCells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括骨髓、脐带、脐带血、牙齿与脂肪。

2000年首次发现了牙髓干细胞，Gronthos等发现在离体的乳牙和智齿中都存在牙髓干细胞。这是一类具有高增殖能力、高度自我更新能力、多项分化能力的细胞。已有研究利用该细胞成功地构建牙髓、牙本质以及牙齿组织。牙髓干细胞(dentalpulpstemcell，DPSC)与其他组织来源的干细胞在生物学特性上有很多相似之处。Gronthos等对牙髓干细胞的克隆形成率进行了研究，与骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcell，BMSC)比较后发现：牙齿来源的DPSC的克隆形成率明显高于骨髓来源的BMSC，这就表明DPSC具有较BMSC更高的增生能力和自我更新能力。Miura等发现：从1颗脱落前牙取材的每12-20个细胞就可以形成黏附克隆集落，这是间质干细胞增殖的典型表现。进一步的实验结果表明：与BMSC和DPSC相比较，SHED有更高的增殖能力。DPSC在不同诱导剂的作用下，可分化为成牙本质细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经样细胞等多种细胞。研究人员主要集中研究牙髓干细胞的体内外成骨的潜能，如Cordeiro等利用牙髓干细胞与生物可降解支架和人牙齿切片复合移植于免疫缺陷小鼠，14～28d后将移植物进行免疫组织化学的检查，结果发现牙本质涎蛋白表达阳性，推断牙髓干细胞在体内能分化为成牙本质样细胞。在成脂、成软骨和成神经诱导方面均有研究证实牙髓干细胞具有多向分化的潜能，为其在体内植入牙髓干细胞使受损或衰退的组织、器官改善或恢复功能提供了理论依据。

目前公开的各类牙髓干细胞制备方法虽均能获得牙髓干细胞，但都不符合临床应用的标准，本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现牙髓干细胞的临床标准产品。

发明内容

针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用。

为实现上述目的，本发明提供促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，该方法包括：

步骤一、选取临床上8～14岁因正畸治疗需要拔除的健康、完整的前磨牙，拔出后立即放入预冷的α-MEM培养液中保存30分钟，α-MEM培养液含2％双抗；

步骤二、在无菌条件下劈开牙冠及牙根，用无菌镊子和探针取出牙髓组织，放在事先准备好的无菌EP管中，用含2％双抗的PBS润洗牙髓组织3遍后，用无菌眼科剪将牙髓组织剪成0.5～1.0mm³的小块；

步骤三、往处理后的牙髓组织块中加入配好的含1％Ⅰ型胶原酶的消化液，来回颠倒EP管，使组织块充分浸到消化液中，将EP管放37℃恒温箱中消化3小时，其中每隔半小时颠倒EP管一次；

步骤四、用同等体积的含10％胎牛血清的α-MEM培养液终止消化，低速离心，弃上清；用含30％胎牛血清的完全培养液重悬沉淀，转移至温度为37℃，二氧化碳浓度为5％的常规培养箱中培养；

步骤五、培养7-10天后，观察到贴壁细胞形成多个克隆，用胰酶消化收集细胞克隆，继续DPSC传代培养，选用传代培养的第三代DPSC，第三代DPSC为纺锤状细胞，流式鉴定检测结果显示DPSC高表达间充质干细胞标志物STRO-1、CD90、CD105和CD146，低表达或不表达造血干细胞标志物CD34、CD45和CD14；

步骤六、在常规培养箱中培养第三代DPSC，待细胞密度达到80％-90％后，放入O₂浓度为3％的缺氧培养箱培养，缺氧时间为12-24小时；用胰蛋白酶消化细胞，PBS漂洗后重悬细胞，即得缺氧DPSC；缺氧处理后进行RealTime-PCR和WesternBlot法检测缺氧DPSC细胞的成血管及成骨的相关基因和蛋白表达情况。

作为本发明的进一步改进，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液为5％Ⅰ型胶原酶200ul与α-MEM培养液800ul混合制得。

作为本发明的进一步改进，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液的加入量为3～5ml。