[发明专利]促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用

权利要求书

1.促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，该方法包括：

步骤一、选取临床上8～14岁因正畸治疗需要拔除的健康、完整的前磨牙，拔出后立即放入预冷的α-MEM培养液中保存30分钟，α-MEM培养液含2％双抗；

步骤二、在无菌条件下劈开牙冠及牙根，用无菌镊子和探针取出牙髓组织，放在事先准备好的无菌EP管中，用含2％双抗的PBS润洗牙髓组织3遍后，用无菌眼科剪将牙髓组织剪成0.5～1.0mm³的小块；

步骤三、往处理后的牙髓组织块中加入配好的含1％Ⅰ型胶原酶的消化液，来回颠倒EP管，使组织块充分浸到消化液中，将EP管放37℃恒温箱中消化3小时，其中每隔半小时颠倒EP管一次；

步骤四、用同等体积的含10％胎牛血清的α-MEM培养液终止消化，低速离心，弃上清；用含30％胎牛血清的完全培养液重悬沉淀，转移至温度为37℃，二氧化碳浓度为5％的常规培养箱中培养；

步骤五、培养7-10天后，观察到贴壁细胞形成多个克隆，用胰酶消化收集细胞克隆，继续DPSC传代培养，选用传代培养的第三代DPSC，第三代DPSC为纺锤状细胞，流式鉴定检测结果显示DPSC高表达间充质干细胞标志物STRO-1、CD90、CD105和CD146，低表达或不表达造血干细胞标志物CD34、CD45和CD14；

步骤六、在常规培养箱中培养第三代DPSC，待细胞密度达到80％-90％后，放入O₂浓度为3％的缺氧培养箱培养，缺氧时间为12-24小时；用胰蛋白酶消化细胞，PBS漂洗后重悬细胞，即得缺氧DPSC；缺氧处理后进行RealTime-PCR和WesternBlot法检测缺氧DPSC细胞的成血管及成骨的相关基因和蛋白表达情况。

2.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液为5％Ⅰ型胶原酶200ul与α-MEM培养液800ul混合制得。

3.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液的加入量为3～5ml。

4.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤四中，所述含30％胎牛血清的完全培养液为胎牛血清：α-MEM：双抗的体积比为30：69：1。

5.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤四中，所述含30％胎牛血清的完全培养液的加入量为3～5ml。

6.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤六中，所述缺氧时间为12小时。

7.根据权利要求1-6中任一权利要求所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法所培养的干细胞的应用，其特征在于，所述干细胞在促进根尖周炎骨愈合中的应用。