[发明专利]检测顺式作用元件有无甲基化修饰或其修饰位点的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及检测顺式作用元件有无甲基化修饰或其修饰位点的方法。

背景技术

转录因子(transcriptionfactor)是一群能与DNA顺式作用元件上特定序列专一性结合的反式作用因子，可保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达。顺式作用元件(cis-actingelement)是存在于基因非编码区能影响基因表达的序列。真核生物的顺式作用元件包括启动子、增强子、隔离子等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码蛋白质，它提供一个作用位点，通过与反式作用因子相互作用来调控基因表达。

顺式作用元件上常常发生DNA甲基化(DNAmethylation)，DNA甲基化是最为常见的一种表观遗传改变。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。人类细胞内，大约有1％的DNA碱基发生了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生于CpG双核苷酸(CpGdinucleotide)部位。其功能主要可归结为以下4个方面：维持基因组遗传物质的稳定性，调控基因的表达，建立表观遗传模式以及参与细胞及胚胎的分化、发育过程。DNA甲基化对正确控制基因表达及细胞身份——使得细胞具有相同遗传物质的细胞变为神经细胞、肌肉细胞或皮肤细胞，起至关重要的作用。

包括癌症在内的某些疾病与DNA甲基化模式发生改变有关联，研究顺式作用元件上的甲基化，可帮助我们了解转录因子与甲基化的关联，并帮助开发出一些新疗法。

目前针对已知特定基因的调控区进行高通量的甲基化分析方法主要是基于ChIP-sequencing法建立起来的。然而，该方法起始的ChIP-DNA至少需要100ng，如果样本较为珍稀，常常不容易获得足够多的量。此外，ChIP-sequencing在后续测序时也常常会运用到全基因组重亚硫酸盐测序技术，将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U(发生甲基化的C不受影响)，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰位点的C碱基区分开来，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。然而该方法会引入大量的亚硫酸氢钠，虽然会经过脱盐处理，但也会不可避免的有亚硫酸氢钠残留，为后续的数据分析带来很多的干扰。

此外，采用甲基化芯片技术或者测序技术，对基因组上的DNA甲基化修饰位点、转录因子的特定结合分别进行测定，利用生物信息学手段对相关区域进行分析，也是目前针对已知特定基因的调控区进行高通量的甲基化分析的常用技术手段之一。但其缺点在于，这种方法不是用同一组样本走完所有流程，在一个表观遗传修饰位点分布异质的细胞群体内，观测到的DNA甲基化与转录因子的直接关联有较大误差。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，可解决传统方法中样本用量多、亚硫酸盐处理后数据分析难度大的问题，能高通量地鉴定出特定顺式作用元件甲基化修饰的所在位点。

本发明的第二目的在于提供一种检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，该方法易于操作，节约成本。

本申请的两种方法的出发点均属于一个总的发明构思，即靶向富集顺式作用元件，再用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以酶切前后的差异特征选取模板设计引物，将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知顺式作用元件甲基化修饰修饰位点或其有无甲基化修饰。

为了实现以上目的，本发明特采用以下技术方案：

一种检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，所述方法包括如下步骤：

靶向富集顺式作用元件，在所述顺式作用元件的两端连接已知序列的小片段DNA，再用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以已连接的小片段DNA为模板设计的引物，将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增，以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知顺式作用元件甲基化修饰位点。

由于对所富集顺式作用元件甲基化位点的信息均未知，且富集顺式作用元件的实验过程中常常需要经过将DNA超声随机打断，为了获取该顺式作用元件上所有甲基化位点的信息，需要将所有被打断的片段的两端均连接已知序列的小片段DNA，再以已连接的小片段DNA为模板设计的引物将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增，以保证所有包含甲基化位点的片段的信息均得到体现。