[发明专利]检测顺式作用元件有无甲基化修饰或其修饰位点的方法

权利要求书

1.一种检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

靶向富集顺式作用元件，在所述顺式作用元件的两端连接已知序列的小片段DNA，再用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以已连接的小片段DNA为模板设计的引物，将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增，以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知顺式作用元件甲基化修饰位点。

2.如权利要求1所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

1)、从全基因组DNA中靶向富集顺式作用元件；

2)、在所述全基因组DNA与富集后的顺式作用元件两端连接已知序列的小片段DNA，分别得到Input-DNA与DNA-S；

3)、将DNA-S用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物DNA-E；

4)、以步骤2)中已知序列的小片段DNA为模板设计引物，对Input-DNA、DNA-S、DNA-E进行扩增；

5)、将步骤4)中扩增得到的DNA进行标记并分别与DNA芯片杂交；

6)、扫描芯片并统计三组芯片的信号值，找到在Input-DNA组、DNA-S组中的信号强度均比DNA-E组中的信号强度有显著性升高的点，即得到特定转录因子结合的DNA元件甲基化修饰位点信息。

3.如权利要求1或2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述靶向富集顺式作用元件的方法包括染色质免疫共沉淀技术、调控元件的甲醛辅助分离技术。

4.如权利要求2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于：

在步骤2)中，所述全基因组DNA与富集后的顺式作用元件的浓度为1～10ng/μl，用量为30～100ng；

在步骤3)中，所述DNA-S的浓度为2～10ng/μl，用量为20～100ng；

在步骤5)中，用于标记的DNA浓度为4～20ng/μl，用量为1～5μg，且用于标记的三组DNA的浓度及用量相同。

5.如权利要求1或2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为McrBC。

6.如权利要求2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，在步骤5)中，所述标记的方法为同位素标记或荧光物质标记。

7.如权利要求2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述DNA芯片包括全基因组甲基化芯片、启动子芯片、CpG岛芯片或增强子芯片。

8.一种检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

靶向富集顺式作用元件，用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以所述的顺式作用元件的DNA序列为模板设计引物将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增，以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知该顺式作用有无甲基化修饰。

9.如权利要求8所述的检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

1)、从全基因组DNA中靶向富集顺式作用元件，得到DNA-S’；

2)、将DNA-S’用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物DNA-E’；

3)、以步骤1)中所述的顺式作用元件的DNA序列为模板设计引物，对DNA-S’、DNA-E’进行扩增；

4)、将步骤3)中DNA-S’、DNA-E’扩增得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和/或实时定量PCR分析是否存在甲基化修饰；

5)、扫描并统计两组电泳泳道的灰度值和/或ΔCT值，比较在DNA-S’组中的信号强度与DNA-E’组中信号强度有无显著性差异，由此判断该特定转录因子结合的DNA元件有无甲基化修饰。

10.如权利要求8或9所述的检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，其特征在于：

所述靶向富集顺式作用元件的方法包括染色质免疫共沉淀技术、调控元件的甲醛辅助分离技术；

所述限制性内切酶包括McrBC、Msp1、HpaII、DpnII，或Msp1、HpaII、DpnII与其相应的同工酶联用。