[发明专利]人iPS细胞向睾丸间质细胞的诱导分化方法及其用途

说明书

本发明提供了一种人诱导多能干细胞(iPS)经神经嵴干细胞(NCSCs)分化为睾丸间质细胞(LCs)的体外定向诱导分化方法，并利用动物模型证实来源于iPS细胞的LCs具备再生衰老或损伤LCs的能力，为性腺功能低下的病人尤其是LOH病人提供新的补充睾酮的方案。

本发明涉及干细胞与组织工程技术领域，具体涉及人iPS细胞向睾丸间质细胞(LCs)的诱导分化方法及其用途。

背景技术

睾丸间质细胞(Leydig cells, LCs)分布于睾丸生精细胞管之间的疏松结缔组织，其分泌的睾酮是成年男性体内睾酮的主要来源。LCs移植是治疗LOH等睾酮缺乏相关疾病的最佳手段，它能够更好的模拟人体睾酮分泌的生理特点，使血清睾酮浓度和睾丸局部睾酮浓度都能得到有效的提高，可以获得更好的治疗效果的同时，尽量避免治疗过程中产生的不良后果。然而，由于LC发育起源不明，而且存在取材困难、数量稀少、扩增困难等缺陷明显制约了其临床应用前景。目前睾丸间质细胞常用的分离方法为密度梯度离心法(GeRS, Dong Q, Sottas CM, Papadopoulos V, Zirkin BR, Hardy MP. In search of ratstem Leydig cells: identification, isolation, and lineage-specificdevelopment. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 2719-2724；Stanley E, Lin CY,Jin S, Liu J, Sottas CM, Ge R, et al. Identification, proliferation, anddifferentiation of adult Leydig stem cells. Endocrinology 2012; 153: 5002-5010.)。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS细胞)具备了与胚胎干细胞相似的自我更新和多向分化潜能，同时因其可来源于自身成体细胞，克服了胚胎干细胞存在的伦理与免疫源性等诸多问题，成为研究人类疾病发病机制、开展组织细胞替代治疗的重要细胞来源。个体来源的成体细胞经过转录因子(KLF4, SOX2, OCT4和c-MYC)导入重编程为多能干细胞，从而使自体移植成为可能。以iPS细胞作为“种子”细胞，可以将其在体外大量扩增并诱导分化为特定的组织细胞。LCs的可能来源包括肾上腺-性腺原基(adrenal-gonadal primordium)、神经嵴(neural crest)、中肾(mesonephros)或者体腔上皮(coelomic epithelium)[Barsoum, I.B. and H.H. Yao, Fetal Leydig cells:progenitor cell maintenance and differentiation. J Androl, 2010. 31(1): p.11-5.]。Davidoff的研究发现，睾丸间质祖细胞表达神经干细胞标志Nestin和周细胞标志NG2，进一步证实了LC细胞有可能是神经嵴起源[Davidoff, M.S., Middendorff, R.,Enikolopov, G., Riethmacher, D., Holstein, A.F., Müller, D., Progenitor cellsof the testosterone-producing Leydig cells revealed. J Cell Biol, 2004. 167(5): p. 935-44.]。

发明内容

本发明人发现，诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS)在体外经神经嵴干细胞(neural crest stem cells，NCSCs)，可以分化为成熟睾丸间质细胞(Leydig cells, LCs)。本发明的目的是提供了一种人诱导多能干细胞(iPS)经神经嵴干细胞(NCSCs)分化为睾丸间质细胞(LCs)的体外定向诱导分化方法，并利用动物模型证实来源于iPS细胞的LCs具备再生衰老或损伤LCs的能力，为性腺功能低下的病人尤其是LOH病人提供新的补充睾酮的方案。