[发明专利]展现剂量响应的性别分选的精子以及生产展现剂量响应的性别分选的精子的方法

说明书

本发明涉及展现剂量响应的性别分选的精子以及生产展现剂量响应的性别分选的精子的方法。所请求保护的发明的实施方式涉及具有改善的剂量响应的性别分选的精子，其可以通过用缓冲保持介质稀释精子样品，以及将经稀释的精子样品的浓度调节到目标浓度范围的步骤来生产。稀释的精子然后可以用DNA选择性染料染色，用流式细胞仪性别分选到捕获液中。在稀释和分选精子样品期间，pH值可以维持在目标pH值。另外，缓冲保持介质、DNA选择性染料和捕获液的至少一种可以补充有至少一种抗氧化剂。

技术领域

一般地，本发明技术涉及染色和分选方法，例如，为分选精子采用的那些方法，更具体地涉及精子分选方法和流式细胞仪方法，它们改善与性别分选精子相关的效率和回收率，以及性别分选的精子中的改善的剂量响应。

背景技术

最广泛使用的精子分选方法依靠检测带有X-染色体的精子和带有Y-染色体的精子的DNA含量方面的可定量差异。在美国专利5,135,759、6,263,745、7,371,517和7,758,811中描述了为此目的对流式细胞仪的各种修改。在许多物种中，DNA含量的差异可能是很小的。例如在牛中，荷斯坦公牛(Holstein bulls)在DNA含量上有约3.8％的差异，而娟姗公牛(Jersey bulls)有约4.1％的差异。化学计量的DNA染色的不精确性质使得这种微小的差异难以确定，并且需要强有力的染色方案。

虽然荧光染料Hoechst 33342适合于在无毒浓度下辨别这样的差异，精子必需在升高的温度和提高的pH值下温育以使Hoechst 33342渗透从而提供均匀的染色。精子是相对脆弱的细胞，它们缺乏复制的能力，一般呈现短的生命期。因而，升高精子温度和改变精子pH值的每一种所引起的损伤可能导致对精子健康的重要损害。另外，在流式细胞仪内施加于精子的压力和剪切力可能进一步损害精子膜。分选过程进一步包括在询问阶段(interrogation stage)将精子细胞暴露于UV激光，以及暴露于电荷以使含有要收集的精子细胞的液滴偏转。最后，一旦分选的精子被排出流式细胞仪，它们以约80-90km/h的速度撞击收集介质。在流式分选过程中这些步骤的每一个中遭受的损伤负面地影响精子健康状态，并可能加速精子膜的劣化，进一步降低了用于人工授精或其他辅助生殖过程的活精子的本已有限的货架寿命。

在辅助生殖技术中利用性别分选的精子的主要缺点是与性别分选的精子相关的降低的受精力。研究表明，通过流式细胞术性别分选的精子的受精力是常规的未分选精子的约75-80％。进一步的，在AI中使用的性别分选的精子的数量增加不能完全补偿低授精力。DeJarmette等，″Effects of sex-sorting and sperm dosage on conception ratesof Holestien Heifers：Is comparable fertility of sex-sorted and conventionalsemen plausible？″Journal of Dairy Science，第94卷，第3477-3483页(2011)。

发明内容

以下概述了请求保护的发明的某些实施方式。这些实施方式的目的不是限制请求保护的发明的范围，而是用于简要描述本发明的可能形式。本发明可以涵盖与这些概述不同的各种形式。

某些实施方式涉及性别分选的授精配剂(dosage)，例如能够在人工授精中受精的、与1500万精子的常规剂量至少处在相同的授精力水平的至少400万经染色和性别分选的精子的群体。在这个实施方式的某些方面，授精配剂可以包括来自处理精子样品的缓冲保持介质的残余量的抗氧化剂，来自处理精子样品的染色剂的残余量的抗氧化剂，和/或来自处理精子的捕获液的残余量的抗氧化剂。