[发明专利]产生β-紫罗酮香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种枸杞（LyciumchinenseMiller）类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoidcleavagedioxygenaseenzyme）的克隆，具体为一种能够产生β-紫罗酮等香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶（LmCCD1）基因的克隆及应用。

背景技术

CCDs是一个古老的小基因家族，其中拟南芥CCDs包括9个同源基因(Tanetal.,2003)，分别为AtCCD1、AtCCD4、AtCCD7、AtCCD8、AtNCED2、AtNCED3、AtNCED5、AtNCED6、AtNCED9，定位在不同的染色体上。CCDs能在特定位点裂解氧化类胡萝卜素而形成多种脱辅基类胡萝卜素，属于一种类胡萝卜素氧化酶，这类酶是非血红素加氧酶(Boucieretal.,2005)。加氧酶在催化过程中可向反应产物上加单氧也可加双氧，单加氧酶需要空气中的一个氧原子，而双加氧酶在其产物中增加2个氧原子(Leuenbergeretal.,2001)。在离体条件下用H₂¹⁸O和¹⁸O标记β-脱辅基-8’-类胡萝卜素的试验显示，拟南芥AtCCD1裂解类胡萝卜素的反应是通过向产物加双氧进行的(Holgeretal.,2006)，这说明CCDs催化类胡萝卜素裂解是一个加双氧的反应，CCDs是一类具有双加氧特性的类胡萝卜素氧化酶。

Schwartz等(2001)实验表明，拟南芥AtCCD1可裂解叶黄素生成β-紫罗酮，裂解β-胡萝卜素生成β-紫罗酮和C14的二醛(4,9-二甲基十二烷-2,4,6,8,10-戊烯-1,12-二醛)，并使玉米黄质转化为3-羟基-β-紫罗酮和3-羟基-α-紫罗酮。AtCCD1还可使全反式紫黄质转化为5,6-环氧-3-羟基-β-紫罗酮，裂解9-顺式-紫黄质的末端的9’,10’顺式双键而生成C27的环氧-脱辅基类胡萝卜醛，使9-顺式-新黄质裂解生成C27的环氧-脱辅基类胡萝卜醛和C27丙二烯脱辅基类胡萝卜醛，C27化合物则进一步裂解为C14二醛和C13的酮(Andrewetal.,2004)。

拟南芥CCD1缺陷型突变体种子中类胡萝卜素的含量增加，表明CCD1在类胡萝卜素催化裂解过程中起作用(Auldirigeetal.,2006)。目前CCD1同源基因已经在番茄(Anderwetal.,2004)、牵牛花(Andrewetal.,2004)、香瓜(Mwafaqetal.,2006)等多种植物中被分离纯化。研究表明，植物类胡萝卜素裂解双加氧酶1(CarotenoidCleavageDioxygenase1，CCD1)在9,10和9’,10’双键位置裂解线型和环型的类胡萝卜素而产生多种天然活性化合物――脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoids)，其中包括一些色素、芳香物质、生长调节剂和防御化合物等。而CCD1的催化活性需要Fe²⁺作为辅因子，它们含有与铁结合的4个组氨酸(Schwartzetal.,1997)。而来源不同植物的CCD1酶的活性有所不同，来自甜瓜的CCD1基因可以裂解全反式八氢番茄红素（phytoene）、番茄红素（lycopene）、β-胡萝卜素（β-carotene）和δ-胡萝卜素（δ-carotene），产生C13产物（MwafaqIbdahetal.,2006）；而来自番红花（Bouvieretal.,2003）和葡萄植物(Mathieu,S.etal.,2005)的CCD1酶只能裂解玉米黄质，产生C13产物3-羟基-β-紫罗酮。Vogel（2008）报道指出，拟南芥、玉米和番茄中的CCD1酶还具有新的裂解位置，即在5,6和（或）5’，6’位置裂解番茄红素，产生芳香物质6-甲基-5-庚烯-2-酮。最近的研究还表明，异源表达水稻CCD1基因可以在C7和C8位置降解单环或无环的类胡萝卜素，产生香叶醛(Ilgetal.2009)。