[发明专利]产生β-紫罗酮香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及应用

权利要求书

1.一个枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，其特征在于该基因为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因全序列。

4.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是质粒表达载体大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-LmCCD1。

5.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组载体的大肠杆菌BL21。

6.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组植物表达载体pCAMBIA2300-LmCCD1。

7.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因全序列。

8.一种权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于它是大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、烟草细胞、玉米细胞或者大豆细胞。

9.权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因（LmCCD1）的克隆方法，其特征在于包括的步骤：

以RNeasyPlantMiniKit试剂盒，从100mg新鲜枸杞叶片中提取TotalRNA，根据转录组Unigene序列中枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的核苷酸序列设计5’端引物CCD1-JF：5’-ATGGGGATGAAAGAAGAGAATGGA-3’，根据NCBI中已登录的番茄、矮牵牛花、马铃薯、烟草的保守核苷酸保守区域设计中间特异性上游引物CCD1-BF：5’-GAGCTTCCWAATTGCTTCAT-3’；利用3'-FULLRACECoreSetVer.2.0试剂盒扩增得到完整的基因序列；具体步骤：

①以TotalRNA为模板，使用3'RACEAdaptor引物进行反转录反应，合成1stStrandcDNA，反应体系如下：

RNA：2μl

3'RACEAdaptor：1μl

5×M-MLVBuffer：2μl

2.5mMdNTPMixture：1μl

RNaseInhibitor：0.25μl

ReverseTranscriptaseM-MLV：0.25μl

RNaseFreedH2O：3.5μl

反应条件：42℃，60min；70℃，15min；

②根据基因的上游引物与上述的试剂盒提供的下游引物3'RACEoutprimer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’，以1stStrandcDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

1stPCR产物：1μl

2.5mMdNTPMixture：2μl

APX-BF：0.5μl

3'RACEoutprimer：0.5μl

10×LAPCRBuffer：2.5μl

TaKaRaLATaq：0.25μl

ddH₂O：18.25μl

Totalvolume25μL

反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环；

根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物P2，以1stStrandcDNA为模板，以5’端特异引物P1和3’端特异引物P2为上下游引物，进行PCR反应，扩增基因的全长；反应体系如下：

1stPCR产物：1μl

2.5mMdNTPMixture：4μl

P1：1μl

P2：1μl

10×LAPCRBuffer：5μl

TaKaRaLATaq：0.5μl

ddH₂O：37.5μl

Totalvolume50μL

反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；52℃，30sec；72℃，2min；72℃，8min，30个循环。

10.一种权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因（LmCCD1）的应用，其特征在于它用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。