[发明专利]荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、生物技术以及临床分子诊断技术领域，特别是涉及荧光定量PCR法检测TOP2A基因mRNA表达的引物、探针及试剂盒。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在西方国家其发病率和病死率居肿瘤之首。近年来，在我国发病率也呈直线上升的趋势，目前浸润性乳腺癌已被视为全身性疾病，其预后的判断及与预后相关的生物学标志物备受关注，由于许多患者亚临床转移灶，以及化疗耐药的出现，导致患者无瘤生存期缩短，检测有关乳腺癌耐药相关基因，对指导规范化治疗尤为重要。

在乳腺癌的研究中发现，TOPOⅡα的基因表达和肿瘤细胞对拓朴异构酶抑制剂的敏感性明显相关，TOP2A基因异常的病人可以明显受益于含有拓朴异构酶抑制剂的辅助化疗方案，TOP2A高表达的病人使用CEF方案进行治疗可以降低61％的复发风险和51％的死亡风险，而TOP2A低表达的患者使用CEF方案只能降低6％的复发风险和10％的死亡风险。

TOP2A基因(TopoisomeraseⅡalpha，TOPⅡα)定位于17q11.2-22区域，编码DNA拓朴异构酶Ⅱα，是核基质成分之一，在核内发挥作用，能调节核酸空间结构动态变化，参与DNA的复制、转录、重组及修复过程。

依托泊苷为细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用于DNA拓扑异构酶Ⅱ，形成药物-酶-DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复。研究发现，依托泊苷的敏感性依赖于其细胞TOPOⅡα蛋白的表达水平。TOPOⅡα高表达的患者可以从依托泊苷治疗中获益。因此使用TOP2A基因mRNA水平来评判患者对含蒽环类药物治疗方案，更为准确。

目前用于检测TOP2AmRNA水平的方法主要有免疫组织化学法，该方法检测时间长，判读受主观因素影响大，不能准确反映TOP2A的表达水平；而cDNA微阵列mRNA表达谱分析(基因芯片)方法又存在灵敏度低、易污染等问题。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种荧光定量检测TOP2A基因mRNA的引物对和Taqman探针，特异性强、灵敏度高，重复性好。

本发明提供的荧光定量检测TOP2A基因mRNA的引物对A和Taqman探针A，其引物对A的核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示，Taqman探针A的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

本发明采用荧光PCR结合Taqman探针法，基于荧光定量PCR技术来检测TOP2A的基因表达水平，设计了目的基因的cDNA扩增引物和特异性Taqman探针，当然地，Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本发明优选报告基团为FAM，淬灭基团为MGB。引物和探针的核苷酸序列具体为：

引物对A：F：5’-AAGTTACCTGAAGCTC-3’(SEQIDNO:1)；

R：5’-GGAAGGTGTTTTTAG-3’(SEQIDNO:2)；

Taqman探针A：5’FAM-TCCCCTCTGAATT-MGB3’(SEQIDNO:3)。

本发明还提供了一种荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的试剂盒，其包括以上所述的荧光定量检测TOP2A基因的引物对A和Taqman探针A。

优选地，上述试剂盒中，还包括用于检测内参基因B2MmRNA的引物对B和Taqman探针B，引物对B的核苷酸序列如SEQIDNO:4～5所示，Taqman探针B的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。优选Taqman探针B的报告基团为FAM，淬灭基团为MGB。选择内参基因B2M的目的是为了增加检测的准确性。相较于其它内参基因，实验表明，B2M较GAPDH及GUSB等为内参的肿瘤和正常组内及组间的表达差异最小，稳定性最佳。

引物对B：F:5’-ATGCTTATACACTTACA-3’(SEQIDNO:4)，

R:5’-ACATGGACATGATCTTC-3’(SEQIDNO:5)；

Taqman探针B：5’FAM-GTAGGGTTATAATA-MGB3’(SEQIDNO:6)。

优选地，上述试剂盒中，还包括B2M标准品、TOP2A标准品。TOP2A标准品为含有梯度浓度TOP2A基因组质粒DNA的溶液，B2M标准品为含有梯度浓度B2M基因组质粒DNA的溶液，标准品是作为该试剂盒的阳性对照及用于标准曲线的制作。