[发明专利]荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.荧光定量检测TOP2A基因mRNA的引物对A和Taqman探针A，其特征在于，引物对A的核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示，Taqman探针A的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

2.根据权利要求1所述的荧光定量检测TOP2A基因的引物对A和Taqman探针A，其特征在于，Taqman探针A的核苷酸序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB。

3.一种荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的荧光定量检测TOP2A基因的引物对A和Taqman探针A。

4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的试剂盒，其特征在于，还包括用于检测内参基因B2MmRNA的引物对B和Taqman探针B，引物对B的核苷酸序列如SEQIDNO:4～5所示，Taqman探针B的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。

5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的试剂盒，其特征在于，还包括TOP2A标准品、B2M标准品和阴性对照品，TOP2A标准品为含有梯度浓度TOP2A基因组质粒DNA的溶液，B2M标准品为含有梯度浓度B2M基因组质粒DNA的溶液。

6.根据权利要求5所述的荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的试剂盒，其特征在于，还包括第一链cDNA合成体系，具体包括反转录酶1～5U、反转录10×RTBuffe适量、dNTPs1～2mM、TOP2A基因反转录引物对1～10pM、内参基因B2M反转录引物对1～10pM，用DEPC水补足至19.5μL；使用时加入样本RNA0.5μg。

7.根据权利要求6所述的荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的试剂盒，其特征在于，试剂盒内共有五管试剂，分别为：

第一链cDNA合成体系；

荧光定量PCR检测反应液：含有TaqDNA聚合酶1～2U、2.0～5.0mmolMgCl₂和0.2～0.8mmoldNTPs的Premix；引物对A1～10pM；Taqman探针A1～10pM；引物对B1～10pM；Taqman探针B1～10pM；DEPC水适量；

TOP2A标准品；

B2M标准品；

阴性对照品：DEPC水。

8.权利要求4～7任一所述的荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以肿瘤组织和癌旁正常组织为待检样品，提取待检样品中的RNA，反转录成样品cDNA；

(2)以样品cDNA作为模板，用引物对A、Taqman探针A、引物对B和Taqman探针B进行荧光定量PCR反应；TOP2A标准品和B2M标准品也分别进行与样品cDNA同样的操作，并根据TOP2A标准品和B2M标准品绘制标准曲线；

(3)结果分析：分析标准曲线的R²在0.99以上，TOP2A基因和B2M基因扩增效率应在94-100％范围，再根据荧光定量PCR仪器给出的Ct值，进行如下计算：

△Ct(肿瘤组织)＝Ct(待检肿瘤组织样品)-Ct(B2M基因)；

△Ct(癌旁正常组织)＝Ct(待检癌旁正常组织样品)-Ct(B2M基因)；

△△Ct＝△Ct(肿瘤组织)-△Ct(癌旁正常组织)；

相对表达率＞1判断为乳腺癌TOP2A基因高表达。

9.根据权利要求8所述的荧光定量PCR法检测TOP2A基因表达的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(2)中荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃15s，60℃30s40个循环；当荧光基团选择FAM时在60℃30s时采集荧光信号。