[发明专利]从含酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法及试剂盒

说明书

本申请公开了一种从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤：将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱上；将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白酶切后的非目的蛋白部分，并且不会吸附目的蛋白；将融合蛋白依次流经第一层析柱和第二层析柱。本发明的方法采用一步层析法，节省了纯化步骤，并且提高了纯化效率。

技术领域

本申请涉及一种从融合蛋白纯化蛋白的方法，具体涉及一种节约程序与成本的酶切纯化蛋白的方法。

背景技术

酶固定化技术在生物技术领域已有使用的先例，比如生物柴油技术，食品工程，废水处理等，但是在制药领域还没有发现相关的技术报道。融合蛋白技术是为获得大量标准蛋白而进行的有目的性的基因融合，利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。例如，有些融合蛋白是含有凝血酶或者肠激酶酶切位点的硫氧还蛋白和目的蛋白融合表达，在后续纯化中采用凝血酶或者肠激酶将硫氧还蛋白和目的蛋白切开，并采用多步柱层析将这两种蛋白分开，达到预期的纯化效果。因此要得到目的蛋白需分为两个步骤：酶切和纯化。目前通过基因工程手段表达有特殊标记的融合蛋白技术已经非常成熟，现有技术中采用静态酶切法，将目的蛋白置换到相应的酶切溶液内，静态酶切一定的时间，然后用不同的层析柱达到分离纯化的目的。

目前的酶切技术通常采用的静态酶切法，是将酶和底物蛋白充分混匀后，在合适的酶切条件下酶将融合蛋白切成目的蛋白和融合头，此时，酶只对它周围能接触到的蛋白产生酶切作用，酶切效率低，酶用量大，另外，酶和蛋白同时溶解在一种溶媒内，后续目的蛋白纯化中会有酶残留的问题。而且酶切时间长，酶和蛋白同时溶解在一种溶媒内，不仅给后续目的蛋白纯化带来影响，而且残留的酶对蛋白有进一步的酶切，使酶切终点不好控制，酶切的变异性增加。经过酶切的蛋白通常需要采用进一步的层析进行纯化，如果接下来纯化不能有效去除酶，则残留的酶会继续发挥作用，从而引入额外的杂质，无法有效的纯化目的蛋白。经过酶切的蛋白溶液内成分较复杂，如果按照常规的层析方法，目的蛋白吸附在层析介质上，然后再根据其不同的表面电荷和疏水性等物理性质将目的蛋白和杂蛋白分开，势必要经过多步层析，每一步层析柱都需要至少五种溶液来完成层析步骤，整个层析工艺比较复杂。每增加一步柱层析，会增加很多工作量，同时蛋白的回收率也会下降，因此用尽可能少的层析步骤达到相同的纯化效果是纯化工艺的最佳境界。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的问题，本申请在蛋白纯化工艺中，发明人巧妙地设计了一种可以一步纯化的方法：采用串联的两个层析柱一次纯化目的蛋白，大大缩减了成本和时间。具体而言，首先，将酶固定在介质上，然后将介质装到层析柱内，制成酶切层析柱，将固定有酶的层析柱和另一根有特定介质的层析柱串联，当融合蛋白在特定的缓冲条件下流经该串联的装置，目的蛋白直接从串联柱流穿，杂蛋白吸附在层析介质上，这样一步层析就可以得到高纯度的目的蛋白。

在一个实施方式中，本发明提供了一种一步从含有酶切位点的融合蛋白中纯化蛋白的方法，包括如下步骤：

将能够对所述酶切位点特异性酶切的酶固定在第一层析柱内的介质上；

将固定有酶的第一层析柱与第二层析柱串联，所述第二层析柱能够吸附所述融合蛋白的非目的蛋白(下文中也称为融合头)部分，并且不会吸附目的蛋白；

将含有所述融合蛋白的样品依次流经第一层析柱和第二层析柱。依照此方法，可以一步获得高纯度的目的蛋白，大大节省了成本，并且避免了多种杂蛋白的产生。

在一个优选的实施方式中，所述酶为凝血酶、肠激酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。在实际操作中，可以根据这些酶的酶切位点来设计融合蛋白的结构，以便能够利用上述酶有效切得目的蛋白。

在一个进一步优选的实施方式中，所述第一层析柱内的介质选自高交联的琼脂糖、葡聚糖和纤维素中的一种。采用适当的固定方法，能够将酶固定到这些介质上。