[发明专利]一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并在其第5位丝氨酸位点处添加磷酸化基团，得到磷酸化抗原合成肽；与之对应，未经磷酸化修饰的为非磷酸化抗原合成肽；

(2)利用步骤(1)合成的磷酸化抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；

(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的磷酸化抗原合成肽通过以下步骤合成：以人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点为中心两侧各毗邻4个氨基酸设计氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的合成肽，并采用多肽合成技术进行合成，在其第5位丝氨酸位点处添加磷酸化基团，同时在N末端连接一个半胱氨酸与载体蛋白血蓝蛋白或牛血清白蛋白进行偶联。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的免疫动物的步骤包括：用步骤(1)合成的磷酸化抗原合成肽与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤包括：将步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对所述磷酸化抗原合成肽的效价及其是否能够特异性识别所述磷酸化抗原合成肽，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以Dot blot和Western blot实验确定抗血清是否能够特异性识别磷酸化NOTCH1 NICD蛋白。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的步骤包括：采用合成肽偶联琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离及亲和纯化；首次采用所述非磷酸化抗原合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；接着使用所述磷酸化抗原合成肽偶联琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。

6.一种人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体，其特征在于，其通过权利要求1至5中任一项所述的方法所制备。

7.一种如权利要求6所述的人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体在制备用于检测发生Ser2162位点磷酸化修饰的人NOTCH1 NICD蛋白的药物制剂中的应用。

8.一种用于检测发生Ser2162位点磷酸化修饰的人NOTCH1 NICD蛋白的药物制剂，其特征在于，包括如权利要求6所述的人NOTCH1 NICD蛋白Ser2162位点磷酸化抗体。

9.一种合成肽在制备用于检测发生Ser2162位点磷酸化修饰的人NOTCH1 NICD蛋白的药物制剂中的应用，其特征在于，所述合成肽为通过如下步骤得到的磷酸化抗原合成肽：合成如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并在其第5位丝氨酸位点处添加磷酸化基团；并且，所述药物制剂为权利要求8所述的药物制剂。