[发明专利]一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株利用单糖发酵产L‑天冬氨酸的基因工程菌，敲除保藏号为CGMCC NO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在aceBA基因的位置处插入L‑天冬氨酸转氨酶基因，得到大肠杆菌AS12；将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L‑天冬氨酸的基因工程菌AS13。本发明实现了完全采用可再生生物质资源（如葡萄糖、木糖等）为原料发酵制备L‑天冬氨酸的路线，该路线绿色、环保。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株利用葡萄糖或木糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门冬氨酸；尤其在食品工业方面，L-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生产原料。具有良好的市场前景。

目前L-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成，而目前富马酸主要采用化学法制备，因此从全周期分析，天冬氨酸的制备仍然依赖化石资源。葡萄糖、木糖等单糖可来源于可再生的生物质资源，其产量丰富，筛选或构建获得一株能够直接利用单糖发酵制备L-天冬氨酸的生产菌株具有重要的意义，目前尚未有相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株利用葡萄糖或木糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，敲除保藏号为CGMCC NO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在aceBA基因的位置处插入L-天冬氨酸转氨酶基因，得到大肠杆菌AS12，所述苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA的GenBank登记号为EU889415.1；

将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌AS13。所述的大肠杆菌CGMCC NO：2301为一株高产富马酸的基因工程菌，该菌株的具体信息在申请号为200810019216.7的专利中已经公开。

其中，所述L-天冬氨酸转氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，L-天冬氨酸转氨酶基因的GenBank登记号为X03629.1。

其中，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的EcoGene登记号为EG10742。

其中，所述的表达质粒为pTrc99a。

上述利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到线性片段1；

以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列为引物，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段2；

以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列为引物，线性片段1和线性片段2为模板扩增得到基因敲除片段；