[发明专利]一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一株利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，敲除保藏号为CGMCCNO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，并在aceBA基因的位置处插入L-天冬氨酸转氨酶基因，得到大肠杆菌AS12；

将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌AS13。

2.根据权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述L-天冬氨酸转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述的表达质粒为pTrc99a。

5.权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到线性片段1；

以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列为引物，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段2；

以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列为引物，线性片段1和线性片段2为模板扩增得到基因敲除片段；

(2) 将pKD46质粒转化CGMCC NO：2301菌株，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态；

(3) 将步骤(1)中基因敲除片段转化步骤(2)得到的感受态中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子；

(4) 将pCP20转化到步骤(3)得到的阳性重组子中，42℃热激使其表达FLP重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为大肠杆菌AS12；

(5) 将SEQ ID NO：2所示pncB基因的核苷酸序列克隆至pTrc99a质粒的Nco I和HindIII酶切位点处，得到pTrc99a-pncB重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AS12，即得到利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌大肠杆菌AS13。

6.权利要求1所述的利用单糖发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌在发酵制备L-天冬氨酸中的应用。