[发明专利]一种玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法。

背景技术

玉米作为重要的粮食作物、饲料以及工业原料，在全球范围内广泛种植。玉米胚乳是籽粒的主要组成部分，玉米的品质与产量同胚乳的发育情况密切相关。胚乳中贮藏的营养物质是人类和动物摄取碳水化合物、蛋白质、半纤维素、脂肪和油脂的主要来源。胚乳重量占玉米籽粒的80％-85％，胚乳的发育、分裂以及充实状况对玉米最终的重量和品质起决定性作用。

灌浆前期为籽粒发育的重要时期，包括多核体的分裂、细胞化、细胞分化以及早期的有丝分裂。深入了解灌浆前期的代谢过程对更好的认识和了解胚乳的结构和功能有重要的理论意义。虽然灌浆前期的物质积累对籽粒最终产量贡献很小，但能够为后续的物质积累提供平台。同时，后续灌浆速率和籽粒最终充实程度受灌浆前期籽粒发育情况的直接影响。因此灌浆前期代谢活动的人工修饰对于研究胚乳发育相关机理以及利用基因工程技术进行高效和安全的作物育种都具有重要的科学意义。

对特异型启动子的筛选及鉴定是基因工程研究的热点。虽然目前研究已经发现了胚乳特异型启动子，并且胚乳特异型启动子在对胚乳组成成分进行遗传修饰和利用胚乳作为生物反应器中发挥了重要作用。但是灌浆前期的胚乳特异型启动子仍未见报道。随着芯片和测序数据的大量公布，可以在整个基因组的范围内大规模的分析基因在特定组织特定发育阶段的表达情况。根据相关基因的表达情况，筛选及鉴定能够驱动基因在特定阶段的玉米胚乳中特异表达的启动子成为了可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法，旨在解决现有技术还没有针对玉米灌浆前期的胚乳特异型启动子的研究的问题。

本发明是这样实现的，一种玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法包括：

步骤一、利用玉米全基因组芯片表达数据，筛选并克隆在灌浆前期玉米胚乳中高效表达的基因启动子；

步骤二、采用实时荧光定量PCR对候选基因的表达特性进行鉴定，筛选出目的基因betl2，克隆其启动子pbetl2；

步骤三、使用PlantCARE对克隆的启动子序列做顺式作用元件分析，同时构建瞬时表达载体；

步骤四、采用基因枪法轰击玉米不同组织，利用GUS组织化学染色法分析pbetl2驱动GUS基因的表达情况；

步骤五、通过玉米叶片原生质体转化观察启动子控制GFP基因在叶片中的表达情况；

步骤六、对启动子在灌浆前期、中期及晚期的表达情况进行分析，并测定启动子活性。

进一步，步骤一所述的利用玉米全基因组芯片表达数据，筛选并克隆在灌浆前期玉米胚乳中高效表达的基因启动子的具体方法为：

首先筛选出主要在胚乳中表达的基因，然后分析基因在授粉后10、17、24天胚乳中的表达数据，选择在灌浆前期的玉米胚乳中特异高表达的基因，筛选方法为前期表达量大于前期、中期及后期表达量均值的一倍，选择授粉后10天表达量最高的前10个候选基因。

进一步，所述的前期指的是授粉后10天，中期指的是授粉后17天，后期指的是授粉后24天。

进一步，步骤二所述的目的基因启动子pbetl2的克隆的具体方法为：

步骤一、根据实时荧光定量PCR以及启动子序列预测的实验结果，初步筛选出主要在灌浆前期胚乳中表达的基因betl2，根据GenBank中betl2基因的mRNA序列，遵循引物设计原则，运用软件PrimerPrimier设计一对特异引物克隆筛选出基因betl2的启动子序列，引物序列如下：

pbetl2-F：CGATATGCCAAGTAGGGACG

pbetl2-R：TATCACCACGCCTGCTTTAT；

步骤二、用玉米B73基因组DNA作为模板，根据设计的引物，用高保真聚合酶KOD酶扩增pbetl2启动子序列，全部反应完成后得到的PCR产物用移液枪点入1％琼脂糖凝胶孔中，电泳120V，30min，检测扩增效果，并拍照保存；

步骤三、紫外灯下小心快速地在琼脂糖凝胶上切下正确的目的片段，放入离心管中并做好标记，采用DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收；

步骤四、将回收到的DNA片段克隆于pMD19-T载体中，16℃连接4-6h；

步骤五、制备大肠杆菌感受态细胞；

步骤六、重组质粒的转化；

步骤七、采用质粒DNA提取试剂盒提取重组质粒；