[发明专利]一种玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法

权利要求书

1.一种玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法，其特征在于，所述的玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法包括：

利用玉米全基因组芯片表达数据，筛选并克隆在灌浆前期玉米胚乳中高效表达的基因启动子；

采用实时荧光定量PCR对候选基因的表达特性进行鉴定，筛选出目的基因betl2，克隆启动子pbetl2；

使用PlantCARE对克隆的启动子序列做顺式作用元件分析，同时构建瞬时表达载体；

采用基因枪法轰击玉米不同组织，利用GUS组织化学染色法分析pbetl2驱动GUS基因的表达情况；

通过玉米叶片原生质体转化观察启动子控制GFP基因在叶片中的表达情况；

对启动子在灌浆前期、中期及晚期的表达情况进行分析，并测定启动子活性。

2.如权利要求1所述的玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法，其特征在于，利用玉米全基因组芯片表达数据，筛选并克隆在灌浆前期玉米胚乳中高效表达的基因启动子的具体方法为：

首先筛选出在胚乳中表达的基因，然后分析基因在授粉后10、17、24天胚乳中的表达数据，选择在灌浆前期的玉米胚乳中特异高表达的基因，筛选方法为前期表达量大于前期、中期及后期表达量均值的一倍，选择授粉后10天表达量最高的前10个候选基因。

3.如权利要求2所述的玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法，其特征在于，前期指的是授粉后10天，中期指的是授粉后17天，后期指的是授粉后24天。

4.如权利要求1所述的玉米灌浆前期胚乳特异型启动子的筛选与鉴定方法，其特征在于，目的基因启动子pbetl2的克隆的具体方法为：

步骤一、根据实时荧光定量PCR以及启动子序列预测的实验结果，初步筛选出主要在灌浆前期胚乳中表达的基因betl2，根据GenBank中betl2基因的mRNA序列，遵循引物设计原则，运用软件PrimerPrimier设计一对特异引物克隆筛选出基因betl2的启动子序列，引物序列如下：

pbetl2-F：CGATATGCCAAGTAGGGACG

pbetl2-R：TATCACCACGCCTGCTTTAT；

步骤二、用玉米B73基因组DNA作为模板，根据设计的引物，用高保真聚合酶KOD酶扩增pbetl2启动子序列，全部反应完成后得到的PCR产物用移液枪点入1％琼脂糖凝胶孔中，电泳120V，30min，检测扩增效果，并拍照保存；

步骤三、紫外灯下小心快速地在琼脂糖凝胶上切下正确的目的片段，放入离心管中并做好标记，采用DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收；

步骤四、将回收到的DNA片段克隆于pMD19-T载体中，16℃连接4-6h；

步骤五、制备大肠杆菌感受态细胞；

步骤六、重组质粒的转化；

步骤七、采用质粒DNA提取试剂盒提取重组质粒；

步骤八、将得到的重组质粒加以命名进行测序，对获得的启动子序列通过DNAMAN软件与GenBank中的原始序列进行比对，验证克隆片段是否正确，将测序正确的菌液每管加入200μl甘油放入-70℃保存。