[发明专利]一种改造尿素代谢调控途径降低酿酒酵母尿素积累的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种改造尿素代谢调控途径降低酿酒酵母尿素积累的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯被认为是一种对人有潜在致癌性的物质，并在1974年被国际癌症研究机构(IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现氨基甲酸乙酯也可以直接诱发人的肝癌，进一步促使IARC在2007年将氨基甲酸乙酯的致癌等级由2B级提升到了2A级(与甲醛同级)。而黄酒中的氨基甲酸乙酯，已经成为危害消费者健康和影响其市场竞争力的重要隐患。

在清酒和黄酒中，由酿酒酵母代谢产生的尿素都是氨基甲酸乙酯最主要的前体物质。在发酵过程中，酵母细胞内的尿素主要由精氨酸代谢产生。酿酒酵母尿素代谢的强弱与两个特异性的激活因子Dal81p和Dal82p的活性密切相关。

Dal81p和Dal82p是酿酒酵母中尿素代谢的两个重要的激活因子，在尿素代谢基因(DUR1,2和DUR3)的启动子上都有它们的结合区。缺少Dal81p和Dal82p的激活作用，DUR1,2和DUR3的表达量将显著的下降。为了增强菌株的尿素代谢能力，可以采取Dal81p和Dal82p过量表达的策略。

泛素化调控是酿酒酵母控制胞内非偏好型氮源代谢的一种方式。在偏好型氮源环境中，非偏好型氮源的透性酶或激活因子可被泛素标记，并被转运至液泡内降解。因此，可以通过对透性酶或激活因子上的泛素化位点进行定点突变，延长这些蛋白在胞内的存留时间，提高非偏好型氮源的代谢速率。

发明内容

本发明通过改造尿素代谢途径相关激活因子，降低了酿酒酵母发酵过程中尿素积累，通过这种遗传改造，可以从根本上减少酿酒酵母发酵过程中尿素的积累。

本发明的第一个目的是提供一种降低酵母尿素积累的方法，所述方法是对尿素代谢途径调控因子Dal81p和Dal82p进行改造。

所述改造是同时过量表达调控因子Dal82p和消除了泛素化调控位点的Dal81p。

在本发明的一种实施方式中，所述Dal81p的泛素化调控位点指的是其第69和918位赖氨酸(K)。

在本发明的一种实施方式中，所述消除了泛素化调控位点的Dal81p是指将氨基酸序列为SEQIDNO.1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突变成丙氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述Dal82p的氨基酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达，指的是将Dal81p_K69A,K918A和Dal82p先后连接到表达载体pY26-GPD-TEF上，构建表达载体pY26-Dal81p_K69A,K918A-Dal82p，并转化到酵母中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体pY26-GPD-TEF的核苷酸序列是SEQIDNO.11所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：将氨基酸序列为SEQIDNO.1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突变成丙氨酸得到Dal81p_K69A,K918A，再将Dal82pDal81p_K69A,K918A和氨基酸序列为SEQIDNO.2的Dal82p先后连接到表达载体pY26-GPD-TEF上，构建得到重组载体pY26-Dal81p_K69A,K918A-Dal82p，并将重组载体转化到宿主酵母中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主酵母是酿酒酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主酵母是酿酒酵母CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8^c；SUC2)单倍体模式菌株。

本发明的第二个目的是提供一种尿素积累能力降低的酵母，所述酵母过表达调控因子Dal82p和消除了泛素化位点的Dal81p。