[发明专利]一种检测呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱

说明书

技术领域

本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域，涉及免疫化学、酶学与分析化学技术等，尤其是涉及一种呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶可视化检测柱的制备。

背景技术

硝基呋喃类(Nitrofurans)是一种广谱抗生素药物，主要包括呋喃它酮(Furaltadone)，呋喃唑酮(Furazolidone)，呋喃妥因(Furantoin)，和呋喃西林(Nitrofurazone)，通过干扰细菌的糖代谢而具有很好的抑菌杀菌作用。主要针对多种革兰氏阳性菌(葡萄球菌、链球菌、梭菌和棒状杆状菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、组织滴虫属和痢疾阿米巴)，并对一些原虫、真菌有一定得作用。硝基呋喃类抗生素同时具有促生长的作用。因其价格低廉且效果较好，抑菌受生物机制影响小，作为外用时对组织的刺激较小，而且菌类对其较少产生耐药性因而被广泛的应用于畜牧业和水产养殖业。硝基呋喃类药物在动物体内极不稳定，很快被代谢完全。进入动物体内后12h即可代谢完毕，但其代谢物分子(AMOZ,AHD,AOZ,SEM)与体内蛋白结合保持长期稳定状态，可残留数周不易代谢出体外极为稳定，通过加工加热等方法(如煎，炸，烤，炖或微波加热等)难以是其分解。这种与蛋白结合状态存在的代谢物对人体造成一定的毒副作用。因此对硝基呋喃类药物的残留检测主要检测其代谢物的残留。目前检测硝基呋喃类抗生素及其代谢物残留的方法主要有：液相色谱质谱联用法(LC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱-紫外法(HPLC-UV)、原子吸收法、紫外分光光度法、酶联免疫法(ELISA)。其中液相色谱串联质谱法是广泛应用的确证方法，方法准确性高，但是前处理方法繁琐，需要昂贵的仪器以及专业的人员操作，检测费用昂贵，不适合进行现场快速检测。因此，积极发展一种灵敏度高、快速、简便的药物残留检测手段势在必行。免疫检测方法，可有效避免样品处理，仪器等因素的制约，而且方法的特异性强，灵敏度高，甚至可以制成试纸用于现场快速检测。然而试纸条检测也易受样品基质的影响，在不同食品样品检测中受到一定限制。本发明阐述的凝胶柱免疫检测产品为某些颜色较深及基质影响较大的样品中的呋喃它酮代谢物残留检测分析提供一种行之有效的可视化定性半定量快速简单的检测方法，为食品安全的有力监管提供可靠的技术保障。

发明内容

本发明提出一种可以定性半定量的检测食品中的呋喃它酮代谢物的简单、省时、灵敏的可视化免疫亲和凝胶检测柱的制备。只要样品中含有酶标记抗原，凝胶检测柱的质控层就会出现蓝色，它可以确保检测柱可以正常检测，达到质控的作用。以凝胶检测柱的质控层为基准，通过检测层颜色深浅变化达到定性或半定量检测食品样品中的呋喃它酮代谢物的目的。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

封闭胶的制备

(1)溶胀：称取0.5g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到40mL的配制好的HCl溶液中，搅拌溶胀15min。

(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mLHCl淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。

(3)封闭：加入9mL甘氨酸封闭液，密封柱子，室温下震荡反应2h。

(4)清洗：首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍。

(5)贮存：待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS悬起，约10mLPBS(含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4℃保存待用。

呋喃它酮代谢物抗体胶和HRP抗体胶的制备

(1)溶胀：准确称取0.25g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到20mL的配制好的HCL溶液中，搅拌溶胀15min。

(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mLHCL淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性，将淋洗液全部淋完。

(3)偶联抗体：取0.5mg(1.00mg/mL)抗体，用1mL的偶联缓冲液稀释，然后加入到在具砂板层析柱中，密封柱子，室温下震荡反应2h。

(4)封闭：加入10mL的偶联缓冲液淋洗柱子，然后加入10mL的封闭液，再次密封柱子，室温震荡反应2h。

(5)清洗：首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍；

(6)贮存：待清洗液抽空，制备好的抗体胶用PBS悬起，约5mLPBS(含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4℃保存待用。