[发明专利]一种检测呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱

权利要求书

1.一种检测呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱，其特征在于：

凝胶检测柱的原理是利用抗原抗体的特异性结合和辣根过氧化物酶的酶催反应，依据质控层和检测层颜色变化，进而对待测物进行定性半定量分析。

2.根据权利要求1所述的呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱，其特征在于：

在一个标准的1mL固相萃取柱内设有两层，上层为呋喃它酮代谢物抗体胶与封闭胶混合加入形成的检测层，下层为HRP抗体胶与封闭胶混合加入形成的质控层，质控层和检测层之间隔开一个3mm的空气层。

3.一种呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱的制备方法，其特征在于：

(1)封闭胶的制备，取0.5gCNBr活化的琼脂糖凝胶，用40mL1mmol/LHCl溶液在具砂板层析柱中溶胀清洗15min，待凝胶完全溶胀后用偶联缓冲液调至中性。然后加入9mL甘氨酸封闭液室温反应2h，目的是封闭凝胶上残余的基团。再用10mL偶联缓冲液和10mL醋酸钠缓冲液交替清洗三次，以调整其pH。制备好的封闭胶用10mLPBS(含有0.03％的Proclin300)稀释重悬，4℃贮存；

(2)抗体胶和HRP抗体胶的制备，取0.25g的溴化氢(CNBr)活化的琼脂糖凝胶，用20mL1mmol/LHCl溶液在具砂板层析柱中溶胀清洗15min，待凝胶完全溶胀后用偶联缓冲液调至中性。取0.5mg的呋喃它酮代谢物多克隆抗体，并用1mL偶联缓冲液对抗体稀释，加入到凝胶中悬起，在室温下用定向摇床振摇2h。使用10mL偶联缓冲液清洗凝胶，去除未偶联上的呋喃它酮代谢物多克隆抗体。再用甘氨酸封闭液溶液将凝胶上残余的活性基团进行封闭，室温下在定向摇床上反应2h。反应完后用10mL偶联缓冲液和10mL醋酸钠缓冲液交替清洗三次，以调整其pH。制备好的凝胶用5mLPBS(含有0.03％的Proclin300)稀释重悬，4℃贮存；

HRP抗体胶由HRP多克隆抗体与CNBr活化的琼脂糖凝胶偶联后制得，用于免疫亲和凝胶检测柱的对照层。HRP抗体胶的制备步骤同抗体胶制备过程。

4.根据权利要求3所述的抗体胶和封闭胶制备方法进行检测柱的组装，其特征在于：

制作步骤为将聚乙烯垫片加入1mL的固相萃取柱中，然后加入150μL的HRP抗体胶与封闭胶比例为1:20的混合胶，加入第二层聚乙烯垫片，用注射器活塞将PBS压出，在组装好的质控层上方约3mm处加入第三层聚乙烯垫片，然后加入150μL的抗体胶与封闭胶比例为1:80的混合胶，最后在顶部加入第四层垫片，用注射器活塞将PBS压出。

5.根据权利要求4所述的组装好的呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱，其特征在于：所述的呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱检测动物源性食品中呋喃它酮代谢物的检测限为3μg/kg。