[发明专利]一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明方法利用黑曲霉来源的酸诱导的启动子，在土曲霉中引入黑曲霉的侧呼吸链蛋白AOX，增强胞内NAD⁺库的供给，进而增强糖酵解途径，从而提高衣康酸的产量。本发明方法得到的重组土曲霉菌株，其衣康酸产量提高了20％左右，达到60g/L。本发明为衣康酸的生产提供了新思路。

技术领域

本发明涉及一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

衣康酸是一种五碳二元羧酸，含有一个亚甲基，这个不饱和键赋予衣康酸行使聚合反应的功能，因此衣康酸被广泛应用于树脂和合成纤维的生产，此外，衣康酸作为生物活性成分可以应用于农业和医药行业，作为酶法转化的初始化合物用于合成多功能的平台化合物。

目前衣康酸的生产主要依赖于利用土曲霉进行深层有氧发酵。土曲霉产衣康酸的代谢途径为葡萄糖通过糖酵解途径和TCA循环合成柠檬酸，并进而合成顺乌头酸，顺乌头酸进入细胞质在乌头酸脱羧酶的催化下合成衣康酸。糖酵解途径和TCA循环的调控严谨，而乌头酸脱羧酶的活性在衣康酸发酵中保持很高的水平，表达单一的蛋白难以达到增强代谢途径的目的，但有文献报道表达解除反馈抑制的截短的pfkA蛋白，可以提高衣康酸产量。

衣康酸发酵需要很高的溶氧，随着溶氧的增加，衣康酸产量增加。这和黑曲霉产柠檬酸需要高溶氧相似。在黑曲霉中由于糖酵解途径的加强，合成过量的NADH，如果通过氧化磷酸化途径使NADH通过产生ATP来形成NAD⁺，会造成ATP的过剩。土曲霉合成衣康酸的途径与黑曲霉产柠檬酸相比，仅增加了2步反应，且都是不需要能量的反应，因此，衣康酸发酵同样面临NAD⁺库的补充和ATP形成解偶联的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用酸诱导的启动子在产酸阶段启动AOX表达，进而提高土曲霉衣康酸产量的方法。由于黑曲霉通过侧呼吸链蛋白AOX来行使NADH到NAD⁺的转变，不产生能量，借鉴这一原理，本发明实现AOX在土曲霉中的表达，以实现NAD⁺库的补充。然而，在菌体生长需要ATP供能的阶段需要AOX蛋白表达沉默，因此本发明进一步利用酸诱导的启动子Pgas，使AOX仅在产酸阶段表达。

本发明的第一个目的是一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法，所述方法是将黑曲霉的AOX基因整合到土曲霉基因组上得到重组土曲霉菌株，利用重组菌发酵生产衣康酸；所述AOX基因的表达受酸诱导型启动子的调控，在酸性条件下诱导表达。

所述AOX基因是a)或者b)：

a)编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的序列；

b)具有使NADH在与ATP产生解偶联的条件下生成NAD⁺的功能，其编码的氨基酸序列是在a)的基础上发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入而得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述AOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述土曲霉菌株是Aspergillus terreus HAT418，或者购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号为CICC 2433、CICC 40205或CICC40832的土曲霉菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述酸诱导型启动子是Pgas，其核苷酸序列是SEQID NO.3所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是在35℃、250r/min下发酵96h。