[发明专利]一种沙门氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种针对沙门氏菌核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对沙门氏菌的定性检测。

(二)背景技术

沙门氏菌广泛存在于自然界，至今已经发现的血清型就有2500种以上,我国已发现216个。与人类疾病有关的血清型主要集中于A～E群，包括：伤寒沙门氏菌、甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌、新港沙门氏菌等，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌最为常见。沙门氏菌引起的食物中毒在日本、欧美占首位，亦是我国细菌性食物中毒的常见菌。在我国内陆地区，有70％～80％细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的，是对人类和动物健康有极大危害的一类食源性病原菌。

沙门氏菌的传统检测多采用细菌培养、生化和血清学鉴定等方法，此类方法操作繁琐、费时费力、所需试剂繁多，经济成本高。随着免疫学和分子生物学的发展，现在已建立了以抗原为主的免疫学检测方法如ELISA法，以及以PCR为基础的检测技术。ELISA操作较为繁琐，费时较长；PCR检测方法快捷，灵敏，准确度较高，但是需要一定的设备和技术要求，且试剂费用较贵，难以推广普及。为了实现基层能广泛进行肠炎沙门氏菌的快速检测，有效防控该类细菌引起的食物中毒，建立实用、简便、快速、准确的肠炎沙门氏菌检测方法十分必要。

近年来，LAMP方法受到关注，该方法以特定核酸为目标在等温条件下通过有链置换酶活性的DNA聚合酶作用而扩增，具有特异性高、灵敏性强，而且简便快速成本低廉的特点。已在微生物检测等诸多领域广泛应用。本发明技术研制了恒温扩增沙门氏菌核酸，并结合核酸试纸条显色来判定结果的检测方法，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该沙门氏菌恒温扩增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点，所以非常适用在基层检验机构使用，同时在突发公共卫生事件的现场检测与临床上的床边诊断上也具有很好的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测沙门氏菌核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种沙门氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：

(1)DNA提取试剂(优选Takara公司的BacterialGenomicDNAExtractionKit(货号DV810A)；

(2)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

所述正向外围引物为：5′-AACAGTGCTCGTTTACGACC-3′(SEQIDNO.2)；

反向外围引物为：5′-CTGATCGATAATGCCAGACG-3′(SEQIDNO.3)；

所述两条探针的序列分别为：

正向5′端Biotin标记探针：5′-Biotin-AGGTAGGTAATGGAATGACGA-3′(SEQIDNO.4)；

反向5′端Fitc标记探针5′-Fitc-CGTTCTACATTGACAGAATCCTCAG-3′(SEQIDNO.5)；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-GCGATCAGGAAATCAACCAGATAGAATGGTGATGATCATTTCTATGTTC-3′(SEQIDNO.6)；

扩增反向引物：

5′-CGTACTGGCGATATTGGTGTTTATATTAACAGTACCGCAGGAAAC-3′(SEQIDNO.7)；

(3)阳性对照：含有沙门氏菌invA基因片段的DNA质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

进一步，本发明所述的1×Thermolbuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH7.5。

进一步，本发明所述阳性对照为含有长238bp的沙门氏菌invA基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列如下(SEQIDNO.1)：