[发明专利]一种沙门氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种沙门氏菌核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成：

(1)DNA提取试剂；

(2)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、1×ThermolBuffer，MgSO₄，dNTPs溶液，BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；

所述正向外围引物为：5′-AACAGTGCTCGTTTACGACC-3′；

反向外围引物为：5′-CTGATCGATAATGCCAGACG-3′；

所述两条探针的序列分别为：

正向5′端Biotin标记探针：5′-Biotin-AGGTAGGTAATGGAATGACGA-3′；

反向5′端Fitc标记探针：5′-Fitc-CGTTCTACATTGACAGAATCCTCAG-3′；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-GCGATCAGGAAATCAACCAGATAGAATGGTGATGATCATTTCTATGTTC-3′；

扩增反向引物：

5′-CGTACTGGCGATATTGGTGTTTATATTAACAGTACCGCAGGAAAC-3′；

(3)阳性对照：含有沙门氏菌invA基因的DNA质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

2.如权利要求1所述沙门氏菌核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述1×ThermolBuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH7.5。

3.如权利要求1所述沙门氏菌核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为含有长238bp的沙门氏菌invA基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

4.如权利要求1所述沙门氏菌核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的沙门氏菌invA基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒定量并稀释至20个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。

5.如权利要求1所述沙门氏菌核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各自10pmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自40pmol，1×Thermolbuffer，MgSO₄为6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，BstDNA聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μl。

6.一种权利要求1所述沙门氏菌核酸恒温扩增检测试剂盒的的检测方法，其特征在于所述检测方法为：

a)用DNA提取试剂从待检测的标本中提取DNA；

b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，标准阳性模板加入阳性对照PCR管中，标准阴性模板加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有沙门氏菌invA基因片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水，在65℃下扩增反应35分钟；

c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有沙门氏菌invA基因DNA核酸。