[发明专利]一种真菌种属PCR鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物物种鉴定，具体涉及真菌种属。

背景技术

真菌的分类鉴定过去一般采用的是形态学方法，主要按照真菌的形态特 征、生长特征、生理生化特点、抗原构造等特征加以区分，尤其是以有性态 的形态特征为主要依据。目前世界上使用最广泛的真菌分类系统是Ainsworth 分类系统，它按真菌孢子的类型和有性态的有无，把真菌分为鞭毛菌、接合 菌、子囊菌、担子菌和半知菌5个亚门。但真菌的种类多，形态和解剖结构复 杂多变，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，且要获得 其有性或无性器官需很长时间(某些真菌如半知菌亚门甚至不能形成有性 态)，常会得出假阳性或假阴性结果，因此鉴定结果不是很准确。近年来，随 着分子生物学的发展，其在真菌分类学中发挥了越来越大的作用，其中rDNA (核糖体DNA)序列分析被广泛使用。

真核生物的核糖体是80S型，包含大亚基60S与小亚基40S。大亚基 60S是由25—28SrRNA、5.8SrRNA和5SrRNA及核糖体蛋白构成；小亚 基40S则由18SrRNA与相关核糖蛋白构成。真核生物细胞中的25—28S rRNA、5.8SrRNA和18SrRNA基因串联构成一个转录本，初始转录的产 物为35S-45SrRNA前体，35S-45SrDNA与5SrDNA串联形成一个重复单 位，150—200个重复单位构成了rDNA簇。5.8S、25S和18S之间的内转 录基因间隔序列为基因内部转录间隔序列(ITS)。

rDNA用以进行物种分类鉴定原理，主要是基于其独特的保守性和适当 的进化速率，使得不同物种间产生相应的碱基差异，这些碱基差异可以通过 相应的技术方法来分析，从而进行菌株的分类鉴定。序列分析、限制性片段 长度多态性RFLP、单链构象多态性SSCP和末端限制性片段长度多态性 T-RFLP等

为主要的技术方法，并且有日益完善的Internet数据库和序列分析软件作 为支持。

研究表明26SrRNA可应用于系统发育分析和菌种鉴定。在大亚基的多 态性研究中，其序列可为12个区域，其中D1和D2两个区域主要用于系 统发育研究和菌种鉴定。26SrDNA的D1/D2区域位于大亚基的5′端，序 列长度在600bp左右。种内序列变异≤1％，而种间序列差异＞1％。扩增常 用通用引物为NL1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和NL4: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'，扩增出的序列结合序列分析、限制性片 段多态性RFLP或单链构象多态性分析，对待测菌株进行分析。

内转录间隔区ITS与5.8SrDNA(internaltranscribedspacer,ITS)是 rDNA上的一个非编码区域，由位于18SrDNA和5.8SrDNA之间的ITS1 区及5.8SrDNA和28SrDNA之间的ITS2区构成，长度约为500bp。该 区域受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点， 在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极 大的序列多态性，可以为真菌学的研究提供丰富的遗传信息。研究时，通常 采用ITS序列的通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，扩增出包括ITS1、5.8S和ITS2的 全长ITS区域序列，长度400～870bp，然后结合DNA序列测定分析和 RFLP分析，对物种进行分类鉴定。由于ITS区不加入成熟核糖体,所以受到的 选择压力较小,进化快,在绝大多数的真核生物中表现出很高的序列多态性， Renske等认为,真菌通过ITS区域比对,序列相似性大于99％,鉴别为同种。ITS序 列间的趋异已经用于真菌中很多属的系统发育研究,已证明该序列在研究属内 和关系较近的属间关系时是十分有价值的,尤其在近似种的区别中。

虽然种内26SD1/D2区碱基差异小于1％的标准已被普遍接受，然而此 数值仍是一个试验的经验值。但真菌的种类非常复杂，不同种真菌的基因组 的进化速率各不相同，跨物种的基因交流(重组、染色体重排、水平转移、 基因渗透)可能会造成核糖体基因簇的某一区段适用于大多数的物种鉴定， 却不能将亲缘关系较近的物种加以区分的现象，或者依赖于单一标记的分类 结果可能无法正确反映该菌株的真实分类地位。有时具有相同D1/D2区序列 的菌株，杂交遗传学和标准特征却表明它们不属于同一个种。