[发明专利]一种真菌种属PCR鉴定方法

权利要求书

1.一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一， 菌株的培养与收集；

步骤二，DNA提取；

步骤三，DNA样品的检测；

步骤四，PCR扩增；

步骤五，测序；

步骤六，序列分析。

2.根据权利要求1所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：所 述菌株在一土豆培养基中进行培养，培养环境在25℃～30℃，光照12h，黑暗 12h，培养2～5天后，所述菌株的菌丝长满所述土豆培养基的表面，直接从所 述土豆培养基表面刮取所述菌丝作为样品；

所述土豆培养基是一固体培养基。

3.根据权利要求1所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：所 述步骤一中，所述菌株在一土豆培养基中进行培养，培养环境在25℃～30℃， 光照12h，黑暗12h，培养2～5天后，所述菌株的菌丝长满所述土豆培养基的 表面；

将菌丝置于一液体土豆培养基中，保持所述液体土豆培养基内的环境在 25℃～30℃，将所述液体土豆培养基以180r/min的速度进行高速离心5～10天， 再收集菌丝作为样品。

4.根据权利要求2或3所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于： 步骤2-1，将所述样品溶解在锥形瓶中形成菌液，抽取1ml～2ml所述菌液于一 第一离心管中，将所述第一离心管以12000r/min离心3min～5min；

步骤2-2，在所述第一离心管中加入500μL十六烷基三甲基溴化铵，将 所述第一离心管放入液氮中迅速制冷30s～40s，在将所述第一离心管迅速放入 60℃～70℃温水中30s～40s，重复步骤2-2三～五次；

步骤2-3，在所述第一离心管中再加入所述第一离心管体积1/3的玻璃珠， 将所述第一离心管放置在一漩涡振荡器进行高速震荡3min～8min；

步骤2-4在所述第一离心管中再加入蛋白酶K，将所述第一离心管在60 ℃～65℃的水中保温30min并且每隔10min摇匀1次。

5.根据权利要求4所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：步 骤2-5在所述第一离心管中加入体积比在20～30:20～25:0.5～1之间的酚、氯仿 和异戊醇；

步骤2-6将所述第一离心管中的上清液移入到第二离心管中，在所述第二 离心管中加入体积比24:1的氯仿和异戊醇，将所述第二离心管以12000r/min 离心10～12min；

步骤2-7在所述第二离心管内加入比所述上清液体积大两倍的无水乙醇， 所述无水乙醇是预冷过的无水乙醇，将所述第二离心管放在-20℃的环境中静 置20min-30min并且以12000r/min离心10min～15min。

6.根据权利要求5所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：步 骤2-8将所述第二离心管内的上清液倒掉留下沉淀，在所述沉淀中加70％的 酒精200μL，再将沉淀在室温中进行干燥；

步骤2-9在所述沉淀中加入100μL的TE缓冲液；

步骤2-10在所述沉淀中加入浓度在10～12mg/mL的核糖核酸酶，在65℃ 环境下保温30min～50min；

步骤2-11，重复步骤2-7～2-9，最后使所述沉淀中的DNA物质溶于50 μL的双蒸水中。

7.根据权利要求6所述的一种真菌种属PCR鉴定方法，其特征在于：所 述DNA物质溶于50μL的双蒸水形成DNA溶液，取5μLDNA溶液置于质 量分数为2％的琼脂糖凝胶中，在电泳缓冲液为1×TBE，电压为120V的条 件下电泳40min，用GoldView染色，在凝胶成像仪上观察DNA分子的大小、 完整性及电泳条带的清晰度，进行拍照。