[发明专利]一种用于制备CTL的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体地，涉及一种用于制备CTL的试剂盒及其应用。

背景技术

目前，癌症已超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，新增病例大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也不断增加，由760万人增加到820万人，到2030年，新增癌症病例将增加50%，达到每年2160万人。癌症是中国居民死亡的主要原因之一，据全国肿瘤登记中心发布的数据显示，目前每年新发肿瘤病例超过300万例，占全球总数的两成，平均每天确诊8550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症，约有250万人死于癌症。预计，到2020年，新发病例将达到390万，因恶性肿瘤而死亡的人数将达294万。手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的三大常规方式，能在短时间内有效减轻肿瘤负荷，但因其不能有效得清除肿瘤细胞，手术后微小残存病灶、对化疗产生耐药及对放疗不敏感的患者肿瘤易发生转移，且副作用大等弊端，使得肿瘤的临床疗效低。肿瘤细胞免疫治疗作为一种全新的肿瘤全身治疗方式，能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，副反应小等良好的临床治疗效果，克服了肿瘤传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端，是目前国际上公认的继手术、放疗和化疗之后最有希望完全消灭肿瘤细胞的第四大治疗肿瘤的新技术。

目前，肿瘤细胞免疫治疗应用于临床的细胞有DC细胞（树突状细胞）、CIK细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）、DC-CIK细胞和CTL细胞（细胞毒性T淋巴细胞）。树突状细胞（DC）源自骨髓中的前体细胞，是迄今发现的功能最强大的抗原提呈细胞，负责对肿瘤抗原的摄取、加工、处理与分类，将肿瘤抗原信息提呈给T细胞，启动肿瘤抗原特异性T细胞应答，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）是将人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导、分化、增殖后获得的一群异质细胞，兼具有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞（自然杀伤细胞）的非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞主要由CD3⁺CD56⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞亚群组成，其中CD3⁺CD56⁺T细胞为自然杀伤活性T细胞（NKT细胞），在正常人外周血中含量极少，具有抗肿瘤活性，CD3⁺CD8⁺T细胞为CTL，是体内抗肿瘤的主要效应细胞。有报道表明，DC和CIK共同培养联合应用可显著提高CIK对肿瘤的杀伤能力。因此，将对肿瘤抗原的摄取、加工、处理后的成熟DC与同源的CIK混合培养，激活的CTL具有肿瘤特异性，能直接靶向作用于肿瘤细胞，对肿瘤细胞杀伤活性高，回输到肿瘤患者体内有助于解除肿瘤患者体内T细胞的免疫无能，从而提高抗肿瘤活性。

目前，CTL细胞的制备主要包括以下几个步骤：DC细胞和T细胞的分离、DC的诱导分化成熟、CIK的诱导增殖、成熟DC-CIK混合培养、以及CTL的诱导增殖。如申请号为CN201410192581.3的中国专利申请中公开了一种制备CTL细胞的方法，该方法制备的CTL细胞中的CD3⁺CD8⁺细胞所占比例较高，约为60-70%，但是该方法还存在以下问题：（1）制备的成熟DC分泌的IL-12水平较低，不能有效的共刺激CIK分化为成熟CTL，使得效应细胞的特异性杀瘤活性降低，需要在混合培养时另外加入适量的IL-12；（2）制备的CTL细胞中初始T细胞的数量较高。

发明内容

本发明提供一种能够解决上述技术问题的CTL试剂盒及CTL的制备方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：

一种用于制备CTL细胞的试剂盒，包括：

（1）DC细胞和T细胞分离体系；

（2）DC的诱导分化成熟体系；

（3）CIK诱导增殖体系，包括：IFN-γ、IL-2以及IL-15；

（4）成熟DC-CIK混合培养体系，包括：IL-18、IL-7以及抗CD28单克隆抗体；

（5）CTL诱导增殖体系，包括：IL-2以及IL-6。

其中，所述（1）DC细胞和T细胞分离体系可以包括：淋巴细胞培养基。