[发明专利]一种用于制备CTL的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，包括：

（1）DC细胞和T细胞分离体系；

（2）DC的诱导分化成熟体系；

（3）CIK诱导增殖体系，包括：IFN-γ、IL-2以及IL-15；

（4）成熟DC-CIK混合培养体系，包括：IL-18、IL-7以及抗CD28单克隆抗体；

（5）CTL诱导增殖体系，包括：IL-2以及IL-6。

2.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（2）DC的诱导分化成熟体系包括：GM-CSF、IL-4以及TNF-α，其中，所述GM-CSF终浓度为50ng/ml；所述IL-4终浓度为25ng/ml、所述TNF-α终浓度为30ng/ml。

3.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（3）CIK诱导增殖体系中，所述IFN-γ终浓度为1000U/ml，所述IL-2终浓度为20ng/ml，所述IL-15终浓度为1ng/ml。

4.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（3）CIK诱导增殖体系还包括抗CD3单克隆抗体以及重组人纤维连接蛋白，所述抗CD3单克隆抗体终浓度为50ng/ml，所述重组人纤维连接蛋白终浓度为1μg/ml。

5.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（4）成熟DC-CIK混合培养体系中，所述IL-18终浓度为5ng/ml，所述IL-7终浓度为10ng/ml，所述抗CD28单克隆抗体终浓度为50ng/ml。

6.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（5）CTL诱导增殖体系中，所述IL-2终浓度为50ng/ml，所述IL-6终浓度为100ng/ml。

7.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（5）CTL诱导增殖体系还包括抗CTLA-4单克隆抗体，所述抗CTLA-4单克隆抗体终浓度为100ng/ml。

8.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括淋巴细胞培养基。

9.应用如权利要求1至8中任一项所述的试剂盒制备CTL的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分离DC细胞和T细胞；

（2）DC细胞的诱导分化及成熟；

（3）诱导增殖CIK细胞：将T淋巴细胞转移至经抗CD3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并加入IFN-γ培养，第2天在培养基中加入IL-2和IL-15，以后根据培养液颜色半量补充IL-2和IL-15；

（4）成熟DC-CIK混合培养：将上述步骤（2）得到的DC细胞及步骤（3）得到的CIK细胞混合，加入IL-18、IL-7以及抗CD28单克隆抗体继续培养；

（5）诱导增殖CTL细胞：加入抗CTLA-4单克隆抗体、IL-2以及IL-6，继续培养3天，即可得到CTL细胞。

10.根据权利要求9所述的制备CTL的方法，其特征在于，所述制备方法具体如下：

（1）分离DC细胞和T细胞：采集并分离PBMC，置于含有自体血浆的淋巴细胞培养基中培养以获得悬浮细胞和贴壁细胞并将所述悬浮细胞和所述贴壁细胞分离；

（2）DC细胞的诱导分化及成熟：贴壁的DC细胞中加入含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基，加入终浓度为50ng/ml的GM-CSF及终浓度为25ng/ml的IL-4，置于37℃、5%CO₂培养箱中扩增培养5天，第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤全抗原50μg/ml，第7天得到负载肿瘤全抗原的DC细胞，并在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为30ng/ml的TNF-α，第8天获得到成熟的DC细胞；

（3）诱导增殖CIK细胞：将T淋巴细胞转移至经终浓度为50ng/ml的抗CD3单克隆抗体和终浓度为1μg/ml的重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为1000U/ml的IFN-γ，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，第2天在培养基中加入终浓度为20ng/ml的IL-2和终浓度为1ng/ml的IL-15，以后根据培养液颜色半量补充IL-2和IL-15；

（4）成熟DC-CIK混合培养：第8天，将上述步骤（2）得到的DC细胞及步骤（3）得到的CIK细胞以10:1的比例混合，在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为5ng/ml的IL-18、终浓度为10ng/ml的IL-7、终浓度为50ng/ml的抗CD28单克隆抗体培养；

（5）诱导增殖CTL细胞：第11天，在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为100ng/ml的抗CTLA-4单克隆抗体，并用终浓度为50ng/ml的IL-2和终浓度为100ng/ml的IL-6继续培养3天即可得到CTL细胞。