[发明专利]一种具有片段选择性纯化能力的高效DNA纯化磁珠试剂

说明书

本发明提供一种具有片段选择性纯化能力的高效DNA纯化磁珠试剂、以及使用该高效DNA纯化磁珠试剂的文库构建方法。即使以微量样本作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库。

技术领域

本发明涉及DNA纯化试剂，具体涉及一种具有片段选择性纯化能力的高效DNA纯化磁珠试剂。

背景技术

目前基于磁珠法进行核酸纯化试剂主要有两类：一类为用于组织样本提取的磁珠提取核酸的试剂，此类试剂通过裂解细胞及溶解蛋白等有机组织，通过特异性的溶液及磁珠颗粒吸附分离核酸分子，对核酸分子进行无差别的回收与纯化。另一类是具有特异性片段选择性纯化能力的磁珠纯化试剂，此类试剂通过特殊的核酸沉淀剂及离子环境以及特异性修饰的纳米磁珠颗粒，可以完成对反应液中的DNA分子进行片段大小特异性的吸附，进而完成片段选择性的回收DNA分子的效果。此种试剂尤其适用于有小片段去除需求，如二代测序文库构建中去除引物二聚体、质粒构建中去除小片段产物等的反应。

另一方面，二代测序也称深度测序、大规模平行测序，其核心思想是边合成边测序。常规的测序前都需要将对待测DNA片段进行一定的处理，构建测序文库，使DNA符合测序平台的要求。

文库构建包含以下几个步骤：(1)待测DNA的片段化，使其适宜进行文库构建及测序；(2)末端修复，将片段化的DNA分子修补形成正常平末端的DNA分子；(3)平末端加A尾，使修复完成的DNA分子具有粘性A末端；(4)加接头，利用带有3'端含有一个突出T碱基的接头分子与带有A末端的DNA分子连接，组成接头连接产物；(5)根据需求进行PCR扩增0-20循环的PCR，完成文库分子的制备。上述5步反应的步骤之间以及文库PCR之后均需要通过例如磁珠纯化法纯化上步的反应产物，用于下步反应。

为了提高纯化效率，构建高品质的测序文库，技术人员对纯化步骤及磁珠纯化试剂进行了各种改进。

例如，中国专利申请公开号CN104099666A(专利文献1)公开了一种二代测序文库构建方法，该方法中合理安排了纯化步骤及纯化方式，获得了高质量的测序文库，且具有快速建库的优点。

再例如，非专利文献1公开了一种具有特异性片段选择性纯化能力的磁珠纯化试剂，其包含：0.1重量％的羧基修饰磁珠、18重量％的PEG8000、1M NaCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)、以及0.05重量％的Tween20。该磁珠纯化试剂具有良好的纯化效率，是目前使用的经典的磁珠纯化试剂。

但是，由于纯化反应本身的效率问题，样本在多步的纯化过程中将逐步损失，并导致最终文库质量不高，此现象对于微量样本(10ng以下)影响尤为严重。

因此，迫切需要纯化效率更高的、更适用于微量样本的磁珠纯化试剂。

参考文献：

专利文献1 中国专利申请公开号CN104099666A；

非专利文献1 Cost-effective,high-throughput DNA sequencing(GenomeResearch，2012，22：939–946)。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种即使以微量样本作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库的具有片段选择性纯化能力的高效DNA纯化磁珠试剂、以及使用该高效DNA纯化磁珠试剂的文库构建方法。

本发明的发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：在采用上述专利文献1公开的二代测序文库构建方法的基础上，使用特定的DNA纯化磁珠试剂，即使以微量样本(10ng以下)作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库，从而完成了本发明。

即，本发明包括：

1.一种DNA纯化磁珠试剂，其包含：