[发明专利]一组核苷酸序列及在沙门菌和志贺菌检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及MERT-LAMP技术在细菌检测中的应用，特别是在沙门菌和志贺菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

志贺菌(Shigellaspp.)和沙门菌(Salmonellaspp.)是两种重要的食源性疾病病原体，是广泛存在于环境中的革兰氏阴性菌。志贺菌和沙门菌常分离自食品样本及临床标本，引起食源性的肠热症，临床症状表现为发热、腹泻。据WHO数据统计，全球每年有180万病人死于腹泻，而绝大多数腹泻病例是由志贺菌和沙门菌导致，从而受到世界各国的高度关注，成为各国的重大公共卫生问题。在发展中国家，志贺菌是引起菌痢的最主要的病原体。然而，无论是在发展中国家还是发达国家，沙门菌是导致食源性疾病最重要的病原体。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗，开展食品监测以及志贺菌和沙门菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够同时检测和鉴定志贺菌和沙门菌成为必要。

目前对于志贺菌和沙门菌的检测主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定。该方法耗时大约5到7天，包括增菌，选择培养及后续的生化鉴定，其劣势是耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于志贺菌和沙门菌的快速检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断志贺菌和沙门菌的PCR方法和Real-timePCR方法，检测灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。

环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是由Notomi等建立的一种新的核酸特异性扩增技术，具有特异性强、灵敏高、操作简单、产物易检测等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。LAMP针对靶序列的6个特异部位设计4条核心引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件(60～65℃)下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。4条核心引物之中2条为内引物，即FIP(Forwardinnerprimer，FIP)和BIP(Backwardinnerprimer，BIP)。FIP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列)，即5′-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2，即5′-Blc-B2。其余两条核心引物为外引物为F3和B3。另外的两条环引物(Loopprimes,LF和LB)被增加到反应体系中加速LAMP反应。LAMP反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA，在1小时之内使产物的量达到10⁹个拷贝。

LAMP扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法是直接在产物中加入SYBRGreenⅠ染色，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性反应，无此现象的则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。然而，这些方法都只能检测LAMP反应是否进行，不能识别针对某一靶序列的特异性扩增，导致LAMP技术只能检测单一目的序列，限制了LAMP技术的运用。

为了克服传统LAMP方法技术瓶颈，本发明人于2015年公开了一种新的MERT-LAMP(MultipleEndonucleaseRestrictionReal-TimeLoop-MediatedIsothermalAmplification)扩增技术(CN104962607A)，即，多限制性内切酶实时环介导等温扩增技术。该专利文献公开的相关技术内容作为引用技术文献被并入到本申请的说明书内容之中。

MERT-LAMP扩增技术以LAMP反应为基础，结合限制性内切酶酶切和荧光检测原理，通过在LAMP扩增中的FIP和/或BIP引物5’端增加限制性酶切位点序列，并在其上标记荧光基团，以及在引物其它部分上标记猝灭基团，扩增产物能够被反应体系中的限制性内切酶特异性的识别、切割，该过程将荧光基团和猝灭基团分开，释放的荧光信号可以通过荧光检测器检测。不同的荧光信号代表了不同的靶序列，从而可以一次扩增完成单种或多种目的基因片段的检测。从而实现一步法多重恒温检测。该方法操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快，因此在诊断检测领域有广泛的应用前景。