[发明专利]角膜缘干细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及角膜缘干细胞的分离方法。

背景技术

角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，与角膜鉴别的标志是Bowman氏膜的终止处；与结膜的鉴别标志是不含杯状细胞，宽约1mm，此处仅有上皮层和基质层，其上皮细胞层超过10层，排列不规则，细胞呈小的圆柱状，核深染，其深部基底细胞为一层小圆柱状或立方形细胞，细胞核为卵圆形，与表面平行.在基底部乳头形成，形成特殊的“栅栏”样上皮结构，其中含有色素和丰富的血管网，并与基底膜联系紧密。

角膜缘干细胞是角膜缘细胞的一个亚群，具有独特的生物学特性：生存期长，分化度低，细胞周期长，DNA合成期短，具有高度的分化和增殖潜能等。干细胞分裂产生两个子细胞，一个保持母细胞表型，继续成为干细胞，另一个演化为具有细胞功能的上皮细胞。在自身更新的组织内干细胞被认为是细胞谱系的起源，同时也是细胞增殖和分化的源泉。

目前开展的角膜缘干细胞移植，包括自体或异体角膜缘组织移植和体外培养的角膜缘干细胞移植。自体角膜缘组织移植，当取供眼角膜缘组织超过2/3周，可导致供眼角膜缘干细胞缺陷，继而引起眼表病变。而且，如果当自体眼已处于亚临床状态时，取材后供眼眼表病变则会加重，进而引起视力下降。此外，自体角膜缘组织移植不适合双眼角膜缘病变的患者。异体角膜缘组织移植存在排斥反应。因此，采用体外培养的角膜缘干细胞移植联合穿透性角膜移植治疗严重的角膜病变，近年来成为人们关注的热点。

角膜缘干细胞的分化阶段大体上分为：角膜缘干细胞(LimbalStemCells，LSCs。在角膜缘基底部的最基层)→短暂扩充细胞(TranscientAmplifyingCell，TAC。在角膜缘的基底部)→有丝分裂后细胞(PostMitoticCells，PMS。位于角膜上皮大多数非表面的区域)→终末分化细胞(TerminallyDifferentiatedCell，TDC。上皮细胞主要位于角膜的浅表)。现在普遍认为，角膜上皮细胞的更新是通过垂直向前的运动和水平向心的运动的方式共同作用实现的，而角膜缘干细胞LSCs则成为其再生的最终源泉。

对于角膜缘干细胞的原代获取，目前已有的分离方法主要有两种：(1)酶消化法。用胰蛋白酶对用含双抗PBS漂洗干净并获取角膜缘组织进行消化，直至细胞分离出来，过筛，离心并接种培养。(2)组织块贴壁法。分别用含双抗的PBS漂洗干净人角膜缘组织，眼科剪把角膜缘组织剪碎成2×2mm³组织块，用培养基接种于培养皿中进行培养。

现有的角膜缘干细胞的原代分离方法中的酶消化法技术，虽然能在短时间内获得数量较多的细胞，但是胰蛋白酶对细胞的贴壁产生影响，在后期分离过程中导致成纤维细胞不易贴壁，使其混在为贴壁的角膜缘细胞中，降低了细胞的纯度。并且，成纤维细胞及其分泌的产物可促进上皮细胞的增殖，刺激角膜缘干细胞向上皮细胞分化，降低了细胞的纯度。

因此，应当进一步开发分离效率高，所得细胞纯度高的角膜缘干细胞的分离方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供角膜缘干细胞的分离方法，本发明提供的方法分离效率高，所得细胞纯度良好。

本发明提供的角膜缘干细胞的分离方法，包括以下步骤：

步骤1：将胎儿角膜缘组织以复合酶酶解；

步骤2：将酶解后的产物以角膜缘干细胞分离培养基培养后，传代；

复合酶包括中性蛋白酶和IV胶原酶；

角膜缘干细胞分离培养基包括AcSDKP、胎牛血清和基础培养液。

本发明将中性蛋白酶和IV胶原酶组合，使角膜缘组织在复合酶的共同作用下酶解，从而保证短时间内酶解获得细胞、减少对细胞的损伤，增大细胞得率。并且，采用本发明提供的复合酶对角膜缘组织进行酶解，对成纤维细胞贴壁效果的影响较小，从而提高了所得细胞的纯度。该方法仅酶解一次，避免了多次酶解多次离心对细胞造成的损伤。

在本发明的实施例中，胎儿角膜缘干细胞取自死亡的胎儿。

在本发明的实施例中，胎儿为兔、大鼠或人类胎儿。

在一些实施例中，胎儿为人类胎儿。

在一些实施例中，人类胎儿的胎龄为3个月～7个月。

在本发明的实施例中，复合酶中中性蛋白酶和IV胶原酶的质量比为3:2～2:1。

在一些实施例中，复合酶中中性蛋白酶和IV胶原酶的质量比为3:2。

在本发明的实施例中，复合酶中中性蛋白酶的质量分数为0.75％～0.8％；IV胶原酶的质量分数为0.4％～0.5％。