[发明专利]筛选具有低咖啡碱性状的茶组植物的特异引物对、等位基因、分子标记及筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种筛选具有低咖啡碱性状的茶组植物的等位基因、分子标记及筛选方法。

背景技术

茶树起源于我国云南省，在植物分类上属于山茶科(Theaceae)、山茶属(Camellia L.)、茶组(Sect.Thea(L.)Dyer)。茶叶因含有丰富的内含成分，其在世界范围内广为流行，是世界三大非酒精饮料之一。目前，世界上有50多个国家栽培茶树，主要集中在亚洲的中国、印度、斯里兰卡、日本和非洲的肯尼亚等国。

咖啡碱是茶叶重要的风味物质及生理活性特征成分，其含量一般在2％～5％。咖啡碱等嘌呤生物碱是以黄苷为底物，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，通过N-甲基化酶类(NMTs)催化的一系列甲基化反应合成的。根据催化底物及转移甲基的位置分别将参与咖啡碱合成的NMTs命名为黄苷甲基转移酶(xanthosine methyltransferase，XMT)、甲基黄嘌呤甲基转移酶(methylxanthine methyltransferase，MXMT)和二甲基黄嘌呤甲基转移酶(dimethylxanthine methyltransferase，DXMT)。根据其合成产物的不同，又将XMT、MXMT和DXMT分别命名为7-甲基黄苷合成酶(MXS)，可可碱合成酶(TS)和咖啡碱合成酶(CS)。在茶树上，Kato等(2000)利用RACE技术首次分离到全长为1438bp的TCS1基因，编码369个氨基酸。茶树TCS1在E.coli中表达，重组酶主要催化N1和N3位置的甲基黄嘌呤，与从茶树体内纯化的CS具有相似的底物特异性。基于TCS1的序列信息，Yoneyama等(2006)克隆与TCS1序列高度相似的TCS2(AB031281)，但TCS2体外重组酶无活性。Yoneyama等(2006)还克隆得到滇缅茶、可可茶与TCS1同源的基因，分别命名为ICS1(AB056108)和PCS1(AB207817)，它们编码的蛋白质只具有N3位甲基化活性。Yoneyama等(2006)构建了TCS1、TCS2和PCS1嵌合体，及PCS1单个氨基酸突变表达载体。结果显示TCS2的1-135氨基酸、PCS1的110-283氨基酸被替换为TCS1的相应片断后获得了咖啡碱合成酶活性，PCS1第221个氨基酸组氨酸被替换为精氨酸后具有合成咖啡碱的能力。我国茶树资源类型丰富，茶组植物有不同的嘌呤生物碱分布模式，特别是从厚轴茶中发现了低咖啡碱资源‘麻栗坡群体’，它与滇缅茶、南昆山毛叶茶在形态特征和生化上差异很大，这些不同形态和嘌呤碱分布模式的资源表明其很可能同滇缅茶、毛叶茶一样，也存在着序列变异大、功能独特的新TCS1等位基因。

咖啡碱具有促进兴奋、强心、解毒、利尿、助消化等多种功效，适度摄入咖啡碱可以兴奋神经中枢，有利于集中注意力、提高反应速度和消除疲劳。但摄入过量的咖啡碱会引起过度兴奋、失眠、心悸易醒、焦燥不安、骨质疏松、血压升高和胚胎畸形等症状，不适于神经衰弱、儿童、孕妇及老人等疾病患者饮用。为满足这类人群的消费需求，就需要生产低咖啡碱含量的茶叶。相对于工业脱咖啡碱的方法，低咖啡碱育种是最有效、经济、安全的方法。

一个新品种的选育都要经过多年重复鉴定。迄今为止，国内外茶叶咖啡碱含量鉴定大都采取生化测定方法。该方法需要一定数量茶树叶片，鉴定的植株需要长到3-4年后才能鉴定，耗费时间过长，效率低下。此外，鉴定植株的咖啡碱含量受栽培环境和茶树树龄影响很大，需要多年、多点鉴定才能做到精准评价。随着分子生物学技术的迅速发展,分子标记辅助选择(MAS)被广泛应用于分子育种中，由于其不受环境和育种世代的影响，可以进行早期选择和预测，大大缩短了茶树育种年限。功能标记是一类基于基因特定序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择的准确性。因此功能标记的开发为茶树分子辅助标记育种提供了依据，通过分子育种手段调控茶树咖啡碱的合成具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选具有低咖啡碱性状的茶组植物的等位基因。

本发明的另一目的是一种用等位基因筛选具有低咖啡碱性状的茶组植物的方法。

本发明的再一目的是提供一种筛选具有低咖啡碱性状的茶组植物的分子标记。

本发明的还有一目的是提供一种分子标记筛选具有低咖啡碱性状的茶组植物的方法。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：