[发明专利]一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，具体是一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法。

背景技术

孔雀石绿（MalachiteGreen）是一种三苯甲烷类物质，又称为盐基块绿、碱性孔雀绿、孔雀绿、碱性绿、中国绿或苯胺绿，为具有金属光泽的深绿色结晶状固体。孔雀石绿具有严重的致癌、致畸和致突变等副作用，2002年我国己将其列入“食品动物禁用的兽药及其化合物清单”及水产养殖禁用药物中。但由于其杀菌效果好，价格便宜，导致有些养殖户还在继续使用，因而发展高通量、准确的水产品孔雀石绿残留检测方法十分重要。

目前我国有关水产品MG的检测方法大多还是基于HPLC和HPLC-MS/MS。这些检测方法存在样品前处理复杂，检测成本高等缺点。因此发展高灵敏、低成本、能从复杂基体中快速检测MG等水产品药残的方法己迫在眉睫。

分子印迹技术的应用可为水产品药物残留的检测提供新的途径，分子印迹技术（molecularimprintingtechnology，MIT)是模仿抗原抗体的反应原理，制备出对目标分子具有专一性识别和选择能力的分子印迹聚合物。该分子印迹聚合物具有构效预定性、特异识别性和广泛适用性的显著特点，目前分子印迹技术已广泛应用于食品等复杂基体中药残的分析。

酶联免疫(ELISA)法检测具有快速、灵敏的优点。与分子印迹技术结合起来，以合成的分子印迹聚合物作为仿生抗体，不仅具有选择特异性，而且可以重复利用。

但传统的酶标板上做分子印迹的方法存在一些不足：（1）有机溶剂的使用，会对酶标板造成不同程度的损坏；（2）合成分子印迹膜除了模板外，还需要功能单体、交联剂、引发剂共同作用，合成过程相对复杂；（3）模板分子的洗脱困难；（4）合成的分子印迹膜在水溶液中的选择性差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，具体检测步骤如下：

（1）MG分子印迹膜的制备

取模板分子孔雀石绿（MG）与多巴胺溶于一定pH的Tris-HCL溶液中，混合均匀后移取200μL于96孔板中，将96孔板置于转速为300r/min的酶标震荡仪上，26～28℃下聚合反应一定时间；

（2）模板的洗脱

用甲醇：乙酸的体积比为8～10:1的超声清洗孔板三次，再用超纯水洗至中性，于60℃下烘干，得到96孔板上的MG分子印迹膜（MIP）；

非分子印迹膜(NIP)的合成除不加入模板分子MG外，其余操作步骤与上述分子印迹膜的制备相同；

（3）半抗原的合成

将4-甲酰基苯甲酸、N,N-二甲基苯胺和无水ZnC1₂溶解在无水乙醇中，氮气保护下加热回流23～25h，冷却至室温，加入甲醇，调节pH至沉淀产生，过滤沉淀，真空干燥后得到羧基化的隐性孔雀石绿（CLMG）；用三氯甲烷溶解CLMG，加入四氯对苯醌和冰醋酸，在24～26℃下搅拌反应1.5h，反应产物经等体积三氯甲烷-四氯甲烷洗涤两次，真空干燥后得到羧基化孔雀石绿（CMG）；

（4）酶标抗原的合成

将CMG溶于质量分数为20%的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液，边磁力搅拌边加入EDC，调pH4.5～5.0，反应18～22min后，迅速加入辣根过氧化物酶（HRP），调pH为7.0，室温反应2.5～3.5h后，得到CMG-HRP偶联物；

（5）检测

准确吸取100μLMG-PBS缓冲溶液于分子印迹膜中，然后立即加入稀释度1:1500的酶标抗原溶液100μL，不加MG溶液的孔为对照组，室温孵育1.5～2.5h，弃上层溶液，每孔加入150μL底物显色液，显色30min后加入50μL终止液，立即在酶标仪上读数，然后计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率，绘制MG直接竞争ELISA标准曲线。

作为本发明进一步的方案：所述步骤（1）中的一定的pH为7.5、8、8.5或9。

作为本发明进一步的方案：所述步骤（1）中聚合反应的时间为3h、5h、7h或9h。

作为本发明进一步的方案：所述步骤（5）中的底物显色液为邻苯二胺。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤（5）中的终止液为2mol/L的硫酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：