[发明专利]一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法

权利要求书

1.一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，具体检测步骤如下：

（1）MG分子印迹膜的制备

取模板分子MG与多巴胺溶于一定pH的Tris-HCL溶液中，混合均匀后移取200μL于96孔板中，将96孔板置于转速为300r/min的酶标震荡仪上，26～28℃下聚合反应一定时间；

（2）模板的洗脱

用甲醇：乙酸的体积比为8～10:1的超声清洗孔板三次，再用超纯水洗至中性，于60℃下烘干，得到96孔板上的MG分子印迹膜；

（3）半抗原的合成

将4-甲酰基苯甲酸、N,N-二甲基苯胺和无水ZnC1₂溶解在无水乙醇中，氮气保护下加热回流23～25h，冷却至室温，加入甲醇，调节pH至沉淀产生，过滤沉淀，真空干燥后得到CLMG；用三氯甲烷溶解CLMG，加入四氯对苯醌和冰醋酸，在24～26℃下搅拌反应1.5h，反应产物经等体积三氯甲烷-四氯甲烷洗涤两次，真空干燥后得到CMG；

（4）酶标抗原的合成

将CMG溶于质量分数为20%的N,N-二甲基甲酰胺溶液，边磁力搅拌边加入EDC，调pH4.5～5.0，反应18～22min后，迅速加入HRP，调pH为7.0，室温反应2.5～3.5h后，得到CMG-HRP偶联物；

（5）检测

准确吸取100μLMG-PBS缓冲溶液于分子印迹膜中，然后立即加入稀释度1:1500的酶标抗原溶液100μL，不加MG溶液的孔为对照组，室温孵育1.5～2.5h，弃上层溶液，每孔加入150μL底物显色液，显色30min后加入50μL终止液，立即在酶标仪上读数，然后计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率，绘制MG直接竞争ELISA标准曲线。

2.根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中的一定的pH为7.5、8、8.5或9。

3.根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中聚合反应的时间为3h、5h、7h或9h。

4.根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的底物显色液为邻苯二胺。

5.根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的终止液为2mol/L的硫酸。