[发明专利]一种快速检测茶树中茶氨酸和谷氨酰胺水解酶活力的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物材料检测技术领域，具体涉及茶树中茶氨酸水解酶和谷氨酰胺水解酶的酶活检测方法。

背景技术

茶氨酸(Theanine，N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)系茶树中特征性非蛋白质氨基酸。目前仅在覃(Xerocomusbadius)和某些山茶属植物(CamelliajaponicaandCamelliasasanqua)中有见报道。茶氨酸占茶树新梢芽叶游离氨基酸总量的70％左右，是绿茶品质形成的重要影响因子。同时，茶氨酸具有镇静安神、抗癌、抗抑郁等重要的生理活性及药理功能。

茶氨酸代谢过程中茶氨酸合成酶、茶氨酸水解酶直接参与了茶氨酸的合成与分解，谷丙转氨酶、丙氨酸脱羧酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、GOGAT、胺氧化酶等参与了茶氨酸合成前提物质谷氨酸和乙胺的代谢。茶氨酸的代谢可分为根部茶氨酸的合成与叶部茶氨酸分解两个过程：茶树根本的丙氨酸脱羧形成的乙胺与谷氨酸在茶氨酸合成酶的作用下生成茶氨酸；然后转移至叶部，在茶氨酸水解酶的作用下分解成谷氨酸和乙胺，乙胺在胺氧化酶的作用下形成乙醛参与叶部儿茶素的代谢。

目前国内外有关茶树中茶氨酸水解酶和谷氨酰胺水解酶酶活力的测定方法均采用高效液相色谱(HPLC)检测产物积累。但HPLC方法存在以下缺点：1、方法繁琐，需要对反应产物萃取分离纯化、浓缩和衍生；2、成本高，需要昂贵的仪器设备及衍生试剂，包括HPLC系统、荧光检测器、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、邻苯二甲醛(OPT)等；3、对人体有毒性，使用的试剂包括DNFB、OPT、乙酸乙酯、甲醇和乙腈等对人体具有毒性，另外易于污染环境；4、分析时间长，采用HPLC法检测一个样品需要1-2小时，工作效率不高，无法适用于大规模筛选分析。而茶氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸性质、结构较为接近，目前所知的可实现大规模分析的纸色谱层析方法又无法将三者完全分离开来，因而也无法用于茶氨酸水解酶和谷氨酰胺水解酶的活性检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对茶树中茶氨酸水解酶和谷氨酰胺水解酶活力的高通量、快速的检测方法，为研究茶树体内茶氨酸代谢、茶氨酸水解酶和谷氨酰胺水解酶的分离纯化、酶蛋白的基因克隆及其功能验证奠定了坚实的实验技术基础。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测茶树中茶氨酸水解酶和谷氨酰胺水解酶酶活力的方法，包括如下步骤：

(1)粗酶液的制备；

(2)粗酶液中蛋白质含量P的检测；

(3)将步骤(1)制得的粗酶液平分，一份粗酶液加入茶氨酸溶液或谷氨酰胺溶液得到水解反应体系样品，反应完成后离心，取上清液；另一份粗酶液经处理作为对照液；

(4)利用高效薄层色谱(HPTLC)检测上清液中水解反应产物谷氨酸的吸光值，代入线性方程，计算得到谷氨酸的浓度N，进而计算得到谷氨酸含量M、茶氨酸水解酶活力或谷氨酰胺水解酶活力；其中，

谷氨酸含量M＝谷氨酸浓度N×水解反应体系样品的体积V；

茶氨酸水解酶活力或谷氨酰胺水解酶活力＝＝M/水解时间(min)/P。

本发明所述的检测方法中，步骤(1)中，将茶树鲜叶样品加入液氮后，快速研磨成粉末状，按1.0﹕0.2～1.0(W/W)加入聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)混匀，再按1﹕10～30(W/V)加入-20℃预冷的磷酸缓冲液，匀浆20s，静置3-5分钟，重复3次；冰浴静置1h，过4层纱布，滤液离心(4℃，18000×g，15min)，所得上清液即为粗酶液。其中，所述磷酸缓冲液配方为：100mM磷酸缓冲盐，1mM二硫苏糖醇(DTT)，5％甘油，1mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)。

本发明所述的检测方法中，步骤(1)中，将制得的粗酶液进一步利用注射器过凝胶柱SephadexG-25，具体操作可参见操作手册；收集前2个柱体积(BV)酶液，以作备用。通过凝胶柱过滤，可有效去除粗酶液中所含茶氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸，消除本底干扰。

本发明所述的检测方法中，步骤(2)中，采用蛋白含量试剂盒测定蛋白质含量(P)；本发明中采用采用Bio-rad公司的RCDC蛋白含量试剂盒的操作程序测定蛋白质含量。