[发明专利]一种快速检测茶树中茶氨酸和谷氨酰胺水解酶活力的方法

权利要求书

1.一种检测茶树中茶氨酸和谷氨酰胺水解酶酶活力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)粗酶液的制备；

(2)粗酶液中蛋白质含量P的检测；

(3)将步骤(1)制得的粗酶液平分，一份粗酶液加入茶氨酸溶液或谷氨酰胺溶液得到水解反应体系样品，反应完成后离心，取上清液；另一份粗酶液经处理作为对照液；

(4)利用高效薄层色谱检测上清液中水解反应产物谷氨酸的吸光值，代入线性方程，计算得到谷氨酸的浓度N，进而计算得到谷氨酸含量M、茶氨酸水解酶活力或谷氨酰胺水解酶活力；

其中：

谷氨酸含量M＝谷氨酸浓度N×水解反应体系样品的体积V；

茶氨酸水解酶活力或谷氨酰胺水解酶活力＝M/水解时间(min)/P。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将茶树鲜叶样品加入液氮后，研磨成粉末状，按1.0﹕0.2～1.0(W/W)加入聚乙烯吡咯烷酮混匀，再按1﹕10～30(W/V)加入-20℃预冷的磷酸缓冲液，匀浆20s，静置3-5分钟，重复3次；冰浴静置1h，过4层纱布，滤液离心，所得上清液即粗酶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将制得的粗酶液利用注射器过凝胶柱SephadexG-25，收集前2个柱体积酶液，备用。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用蛋白含量试剂盒测定蛋白质含量P。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述水解反应条件为：25～38℃水浴，反应30～90min，pH7～9；优选所述水解反应条件为：35℃水浴，反应60min，pH8.5。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述茶氨酸溶液的浓度为50mM；所述谷氨酰胺溶液的浓度为70mM。

7.根据权利要求1、3、5任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述检测步骤如下：

a)、将硅胶预制板于120℃条件下活化lh，放于干燥器冷却；

b)、将展开剂I、II倒入展开缸，静置饱和约30min；

所述展开剂Ⅰ由正丁醇：丙酮：乙酸：水按体积比14:14:3:4配制；

所述展开剂Ⅱ由正丁醇：丙酮：乙酸：水按体积比14:14:3:4配制，其中，展开剂II中还含0.2％W/V茚三酮；

c)、取10μL水解反应体系样品，带状点样，点样数6条，宽度8mm，点样高度距底端10mm；

d)、点样后，将硅胶板于展开剂Ⅰ中展开，待展开剂跑至硅胶板顶端1cm时取出，热风吹干；待硅胶板冷却至室温后于展开剂Ⅱ中展开，待展开剂跑至硅胶板顶端1cm时取出，热风吹干至条带氨基酸颜色逐渐清晰；

e)、将谷氨酸条带自硅胶板刮取于离心管中，加入5mL75％乙醇，于50℃水浴提取10min，室温离心，取上清液，冷却待测；

f)、以75％乙醇作为空白对照，在570nm处测定步骤e)所得上清液的吸光值A₅₇₀。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，每次检测需以1.00mmol/L～10.00mmol/L谷氨酸标准品制作吸光值对谷氨酸浓度的标准曲线，得出线性方程，并计算谷氨酸浓度N。