[发明专利]一种与凡纳滨对虾低溶氧耐受性相关的SNP标记及其筛选和应用

权利要求书

1.一种辅助选育低溶氧耐受性凡纳滨对虾的方法，其特征在于：

（A）凡纳滨对虾DNA提取：取凡纳滨对虾肌肉0.2g，加入400μL 1×TE裂解液剪碎，依次加入200μL 10%的SDS、8μL 蛋白酶K 20mg/mL，37℃裂解30min，再置于55℃消化1-2h至澄清透明；往澄清的裂解液中加入等体积酚/氯仿/异戊醇溶液，酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1，颠倒充分混匀，12000rpm离心20min；小心移取上清液至新的离心管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇，氯仿/异戊醇体积比为24:1，颠倒充分混匀，离心15min，抽提2到3次；小心移取上清液至新的离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒充分混匀，放入-20℃冰箱内静置30min；12000rpm离心15min，弃上清，加入70%乙醇洗涤2-3次，每次离心2min，室温晾干，加入150μL1×TE Buffer保存；用1%琼脂糖凝胶检测样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度；

（B）利用NCBI中凡纳滨对虾过氧化氢酶基因mRNA GenBank Accession NO.JX162772.1序列，通过Premier Primier 3.0软件设计得到特异性引物对CAT-FP和CAT-RP；以经低溶氧胁迫96小时实验后死亡群体和存活群体凡纳滨对虾44个基因组DNA为模板，利用上述引物在PCR条件下进行扩增；PCR反应体系为25μL：DNA模板40ng，10×Mg²⁺ plus PCR Buffer 2.5μL，dNTP Mix 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，5U/μL rTaq酶0.2μL；PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性45S，58℃退火45s，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；将PCR产物直接送进行测序；引物CAT-FP和CAT-RP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

（C）采用直接测序法对凡纳滨对虾进行SNP检测，在某一碱基处出现双峰则说明是杂合型，单峰则是纯合子，将测序后的序列与GenBank中凡纳滨对虾过氧化氢酶基因进行比对，得出突变纯合型；

（D）在耐低溶氧凡纳滨对虾的选择育种过程中，对凡纳滨对虾育种候选群体进行位点155A>G分型，优先选择位点155A>G为AG型的个体，作为耐低溶氧凡纳滨对虾选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择155位点为GG作为亲本或者进行规模养殖。