[发明专利]一种纯化脊髓灰质炎病毒液的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品制备领域，具体地，涉及一种脊髓灰质炎病毒灭活疫苗制备过程中的纯化脊髓灰质炎病毒液的方法。

背景技术

脊髓灰质炎病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，内含单股正链RNA基因，蛋白衣壳为二十面体立体对称结构，无包膜。脊髓灰质炎病毒有3种血清型，分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。脊髓灰质炎病毒颗粒包括实心结构病毒颗粒和空心结构病毒颗粒，其中实心结构病毒颗粒能与机体细胞反应产生中和抗体。

脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的具有很强传染力的疾病，主要感染五岁以下的儿童。1/200的患者会产生不可逆的腿部瘫痪，更严重的会导致吞咽和说话的困难。有5-10％的患者因为呼吸肌麻痹导致死亡。目前尚无治疗脊灰的有效手段，脊髓灰质炎疫苗的接种是最有效的预防该疾病发生和传染的方法。

目前上市的脊髓灰质炎病毒疫苗有减毒疫苗(OPV)和灭活疫苗(IPV)。OPV是多数国家计划免疫中的主要疫苗品种之一。1985年至2003年有超过5.5亿儿童在94个国家已经接种了OPV疫苗。虽然OPV为消除脊灰发挥了重要作用，但OPV的接种引起的脊灰疫苗相关病例(VAPP)和脊髓灰质炎疫苗衍生株(VDPV)威胁始终存在，甚至成为影响公众健康、社会稳定的问题。为了彻底消除脊灰，WHO制定了全球消除脊灰行动计划，预计到2015年消除脊灰野病毒并在2018年认证全球无脊灰状态。在此过程中，将逐步使用IPV和sIPV代替OPV。

IPV使用野毒株salk株作为生产原料，对生物安全等级要求严格，因此生产商的数量十分有限；此外，由于IPV的价格相对高昂，主要用于发达国家的计划免疫和发展中国家的私人市场。

WHO推荐发展中国家在消灭脊灰最后阶段使用一种由减毒株(Sabin株)生产的新型灭活脊灰疫苗来代替OPV疫苗的使用，从而彻底消除因接种该疫苗导致的VDPV和VAPP的发生。这在消灭脊灰的最后阶段并全面使用灭活疫苗的背景下，具有重要的补充意义：使用减毒株生产的Sabin-IPV，较使用野毒株(Salk株)生产的IPV灭活疫苗，具有生产更安全、成本更低廉的特点，更适合在发展中国家推广使用。在中国境内不允许使用野毒株来生产IPV，所以用Sabin株生产IPV成为必然。

传统的sIPV疫苗纯化工艺通常包括超滤浓缩、离子交换层析、除菌过滤等步骤。离子交换层析的分离方法在sIPV疫苗纯化工艺中成本比较高，且无法有效地将实心病毒颗粒与空心病毒颗粒分离。此外，由于实心病毒能与机体细胞反应，诱导机体产生中和抗体，并经大鼠体内免疫原性试验证实：实心病毒颗粒产生的中和抗体至少是空心病毒颗粒的10倍。因此，亟待需要一种新的纯化方法，可以将sIPV两种不同的病毒形态分离，以提高脊髓灰质炎病毒液的有效滴度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纯化脊髓灰质炎病毒液的方法。

本发明对sIPV的传统纯化工艺进行了改进，将原有的离子交换层析工艺步骤替换为密度梯度离心(或者连续流密度梯度离心)工艺。纯化脊髓灰质炎病毒采用的密度介质为蔗糖溶液，蔗糖分为高浓度蔗糖溶液和低浓度蔗糖溶液。高浓度蔗糖溶液为55％～60％，低浓度蔗糖溶液为：25％～45％。根据蔗糖密度可以有效的分离具有免疫原性的实心病毒颗粒(沉降系数约150S)和免疫原性较差或无免疫原性的空心病毒颗粒(沉降系数约80S)，从而达到选择性收集目标区域的目的。

本发明有效地解决了层析方法不能将实心病毒颗粒与空心病毒颗粒分离的难题，不仅提高了单位剂量sIPV病毒液的免疫原性，而且大大降低了以此病毒液制备得到的疫苗使用后的副反应，同时降低了生产成本。

本发明提供了一种纯化病毒液的方法，包括：

(1)待纯化的病毒超滤浓缩液进行蔗糖密度梯度离心；

(2)监测糖度，收集合并处于相同位置的离心液。

步骤(1)的蔗糖密度梯度离心方法为：

依次从离心机边孔以50～100rpm依次泵入超离缓冲液，病毒超滤浓缩液,低浓度蔗糖溶液，最后以50～150rpm泵入高浓度蔗糖溶液直至中孔流出液体；离心转速为28000～35000rpm，离心时间为：6～20小时，离心温度为2～8℃。

本发明纯化病毒液的方法中，超离缓冲液与病毒超滤浓缩液的体积比为1：5～1：10；病毒超滤浓缩液与低浓度蔗糖溶液的体积比为1：1～2：1；高浓度蔗糖加入标准为只要离心机中空流出液体即可停止加入高浓度蔗糖。