[发明专利]一株高效降解琼胶多糖的海洋杆菌

说明书

本发明公开了一种海洋杆菌G4，该菌株为Marinobacter adhaerens，保藏编号：CGMCC No.11016。该菌株具有稳定高产β‑琼胶酶的能力，能够高效降解琼胶多糖，生成新琼四糖。经过48h驯化培养后的菌株G4菌液，其上清液的酶活可达323.48U/mL。本发明同时提供了利用海洋杆菌G4制备β‑琼胶酶粗酶的方法，该方法具有快速、简便的特点。另外，本发明还提供了一种利用海洋杆菌G4产β‑琼胶酶粗酶制备新琼四糖的方法。

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种能够高效降解琼胶多糖的海洋杆菌属细菌。

背景技术

琼胶是江蓠、石花菜等大型经济红藻中的主要组成成分，被广泛应用于生化、临床、医药和食品等领域。但琼胶(多糖)需要特异性酶进行降解的特性成为阻碍大型经济海藻进一步高值化和能源化利用的瓶颈。

琼胶酶是一类可特异性降解琼胶多糖的酶，目前已发现的琼胶酶根据其酶解糖苷键的不同，主要分为α-琼胶酶(作用位点为α-1,3糖苷键)和β-琼胶酶(作用位点为β-1,4糖苷键)两类。根据琼胶酶序列和功能分析结果可将其分为六大类glycosidic hydrolase(GH)family，分别为GH16、GH50、GH86、GH96、GH117和GH118.其中GH96和GH117类琼胶酶为α-琼胶酶，其酶解产物为琼胶四糖、琼胶六糖或D-galactose和3,6-anhydro-L-galactose；其它类琼胶酶皆为β-琼胶酶，其酶解产物为新琼十糖、新琼八糖、新琼六糖、新琼四糖和新琼二糖。不同微生物的琼胶酶酶解产生的琼胶寡糖不同，有的是单一的寡糖，有的则是两种寡糖的混合物。

目前糖生物学及糖化学领域的研究表明海藻低聚糖具有许多良好的生物学活性，在新药和保健品开发等领域具有广泛的应用价值。在海藻低聚糖的制备方面，琼胶低聚糖的特异性酶降解制备法因效率高、专一性强、反应条件温和作用时间短等优势成为近年来的主要研究方向，但由于特异性琼胶酶目前仍存在产量低、分离难度大、低聚糖产生量低等问题，使其在工业生产中的应用受到了限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效降解琼胶多糖的海洋杆菌，以及利用该菌株制备琼胶酶和琼胶寡糖的方法。

本发明提供一株能够高效降解琼胶多糖的海洋杆菌菌株G4，该菌株为Marinobacter adhaerens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.11016，保藏日期：2015年6月24日。

该海洋杆菌筛选自富含琼胶的大型野生海藻藻体，依次经过筛选源(藻体)的富集培养、菌群的驯化培养、单菌落的分离步骤，以及菌株的反复分离纯化步骤后获得。该海洋杆菌为革兰氏阴性，细胞外部形态呈短杆状(图1)，其16SrDNA序列见序列表1，图2为根据16SrDNA序列构建的海洋杆菌G4及其相关种的系统发育树。该菌株具有稳定高产β-琼胶酶的能力，能够高效降解琼胶多糖，生成新琼四糖。菌株在2216E固体培养基上培养48h后即可在琼脂平板上形成明显凹陷，用卢戈氏碘液对琼脂平板染色，可清晰反衬出凹陷的浅色或无色的溶解圈或液化圈(图3)。

本发明还提供一种利用所述海洋杆菌G4制备β-琼胶酶粗酶的方法。具体如下：

(1)将活化的海洋杆菌G4接种至添加有微生物生长所必需的碳源和氮源的海水中培养数天；

(2)收集菌液，离心后取上清液，采用(NH₄)₂SO₄盐析沉淀法提取胞外蛋白，为使蛋白充分沉淀，可将上清液低温静置过夜后再离心收集蛋白沉淀；

(3)将获得的蛋白沉淀用中性缓冲液复溶，即获得含有β-琼胶酶的粗酶液。